细胞培养技术的研究进展

宋 鸿，韩云竹，蔡国徽

(遵义医学院 微生物学教研室，贵州 遵义 563099)

细胞是高等生物有机体一切生命活动的基本单位，个体发育过程中无数功能及形态各异的细胞形成了不同的组织和器官，这个复杂的过程不仅受遗传物质的调控，更离不开三维立体微环境中各种细胞因子、生长因子、细胞间及细胞与细胞外基质(extra- cellular matrix，ECM)间相互粘附等多种信号的调节。体外细胞培养技术就是在体外维持细胞、组织及器官生存及生长的一种技术。根据细胞培养对象，可采用不同的方法和技术。传统的细胞体外研究多采用单层细胞培养法，培养装置常为玻璃或塑料的二维平面。事实上，这种培养方法是无法模拟具有空间结构的ECM与细胞之间的相互作用，许多细胞从组织中分离并进行二维平面培养后，会逐渐平面化、异常分化并失去分化表型[1]。数十年来人们逐渐认识到，细胞外微环境中各种细胞因子、神经递质、细胞之间及细胞与ECM相互粘附等多种信号积极参与了调节细胞的生长、分化、增殖及凋亡等生命活动[2-4]。因此细胞培养技术经过不断的改进，经历了由二维到三维，由静止三维培养到动力三维培养的过程。现将细胞培养技术的发展、细胞培养支架材料以及细胞培养的影响因素进行综述。

1 二维细胞培养

1907年，Harrison用悬滴培养法培养蛙胚神经获得成功，创立了最早的动物细胞二维培养法，经过不断改进，发展到现代的培养瓶、培养皿培养。由于二维培养方法具有培养简单、易操作、费用低、可大批量应用等优点，因此已经成为了体外细胞培养的主要方法。然而，这种培养方式存在着许多缺点：首先，在体内组织细胞所处的局部微环境是三维立体的，它们的运动经常受到局部化学信号或分子梯度的影响，分子梯度对于细胞的分化、组织器官的形成、信号传导、神经信号传递及许多生物代谢过程起着重要的作用，但是在常规的体外二维培养方法中几乎是不可能建立这种的三维分子梯度的，因此二维培养不能够为组织细胞提供正常生长发育的环境条件，而生长环境对细胞基因表达及行为有着重要的影响。有研究发现，从小鼠体内得到的具有多药耐药性的肿瘤细胞[5]，在体外进行二维培养后，其多药耐药性会消失，而在三维培养条件下，会恢复其多药耐药性[6]。由此可见以单层细胞为模型，研究肿瘤对放化疗敏感性，所得到的结果与体内试验往往存在很大的差距[5,7]；其次，直接从机体中分离得到的原代细胞，在二维培养条件下它们的代谢及基因表达谱会发生不断地变化。虽然在组织和器官中ECM蛋白和细胞受体之间的相互作用是普遍存在的现象，但细胞结构决定了细胞活性。细胞膜结构、ECM及基底膜经蛋白与蛋白之间的相互作用影响着整个细胞的代谢过程。在二维培养中常需要调节细胞的密度，以便于细胞适应外在环境，这不仅仅改变了氧气、营养物质和ECM间的相互作用，也改变了细胞内代谢产物的清除；此外，细胞在二维环境生长过程中可使ECM蛋白和细胞形态发生改变，这可能是由于细胞表面的受体首先聚集在直接暴露于培养液的细胞局部所导致，然而实际上在机体内粘附于细胞表面的受体是很少有机会聚集的，因此在二维培养条件下这种聚集现象可能导致细胞表面的受体位置偏离，从而影响了细胞间的相互作用；除此之外，在二维培养中，细胞附在底物平面上生长，因缺少立体支架，只能向二维发展，细胞失去原有的立体形态。因此，二维培养所反映的生物学性状，与体内组织细胞相差甚远。通常的结果是细胞发生去分化现象，培养的细胞不仅失去了正常的形态，而且失去了其生化与功能特性，如软骨细胞在单层培养过程中，呈现出类似成纤维细胞的去分化形态，并且由正常条件下的分泌Ⅱ型胶原转变到分泌Ⅰ型胶原[8]，这一形态与功能变化与培养条件有关。可见体外组织细胞的培养受到众多因素的影响，二维培养已不能满足组织细胞正常生长发育所需的局部微环境。

2 三维细胞培养及其支架材料

随着对细胞所处微环境的了解，细胞培养技术经历了从二维到三维的发展过程。三维培养就是利用各种方法及材料，使细胞呈空间立体方式生长。这种生长方式更接近于体内生长模式，形成类似体内的组织结构，发挥其功能，因此三维培养体系为细胞提供了类似体内生长环境的支架或基质，同时细胞通过紧密连接和缝隙连接等方式建立了细胞间及细胞与ECM间的联系，形成了一定的三维结构。

East等[9]使用三维培养系统记录了不同肿瘤通过正常组织每天的移动速率后，推进了细胞三维培养技术的迅速发展。现研究发现体外细胞三维培养受到众多因素的影响，如种子细胞、生物支架材料、生长因子、力学环境等[10]，其中生物支架材料的影响尤为重要。在过去的20年中，一些生物聚合材料如PLLA、PLGA、PLLA-PLGA共聚物，及生物材料如藻酸盐、琼脂糖、胶原等[11-14]已经被广泛用于体外细胞三维培养中，这些培养体系最突破性进展强调了生物材料模拟自然发生的三维细胞与细胞之间、细胞与生物材料支架之间的相互作用，可以说细胞三维培养技术促进了组织工程学的发展，为其开创了一个新领域[15]。

合成聚合物或共混聚合物材料的目的就是建立体外细胞三维培养，然而这些聚合物生物材料的微纤维直径一般为10～50 μm，与大部分细胞的直径(5～30 μm)相近，这使得吸附在微纤维上的细胞处于二维弧形环境里，实际上细胞仍处于一种二维培养环境中。此外，这些聚合物生物材料所形成支架网孔直径一般为10～200 mm，这比一般的生物分子大了1000～10 000倍，结果导致生物分子快速扩散，因此对于一个真正而言的三维环境，构成支架的纤维及所形成的网孔直径一定比培养细胞小的多，这样细胞被支架纤维所包绕，这就好比模拟体内环境，使细胞处于一种ECM环境中[16]。

此外，一些来源于动物的生物材料如胶原蛋白、粘多糖及Matrigel等用于细胞三维培养中[17-19]，但是对于所有动物来源的材料来说，一个潜在的问题就是它们可能携带危险的病原菌[20]，如朊病毒是最令人担心的病原菌，或经常会带有一些残留的生长因子及一些成分不清或数量不确定的混杂物，这将导致产品的质量比较难控制。这些问题不仅给实验研究带来了困难，也为组织工程用于人体疾病的治疗带来了巨大的麻烦。因此，理想的三维培养体系必须明确细胞支架合成生物材料的组分，就这而言，分子自组装肽支架有可能被选择用作细胞三维培养支架。分子自组装肽支架因成分纯净、性能稳定、无免疫原性且降解产物无毒、具有较好的生物相容性及可调控的生物降解性[21]，被视为理想的细胞培养支架材料。已有研究表明，自组装短肽RADA16具有良好的结构与性能，能提供类似ECM结构的微环境，较好的进行神经细胞、软骨细胞、肝细胞等的体外三维培养[21-22]。

3 细胞培养的影响因素

3.1 细胞粘附与相关结构 肿瘤侵袭过程中，肿瘤细胞必须先与ECM发生接触，随后酶解并穿过ECM，而与ECM及其邻近细胞的粘附决定了肿瘤细胞的形态及其组织结构特性。此外，为了调节生长、分化、增殖及迁移等细胞行为，细胞需要综合粘附的成分、结构、数量等多种信号[23]。故体外研究细胞的生物学行为需将细胞从原生细胞间及细胞与ECM的相互作用中剥离，再引入设定的二维或三维培养新环境中。

二维与三维细胞体外培养最显著的区别在于细胞形貌的差异。当细胞在二维平面生长时，很容易在水平表面粘附、迁移，但无法在空间层面扩展。原因之一是细胞生长在二维平面时存在顶底极性，这种极性与某些类型的细胞有关，如上皮细胞，但大多数间充质细胞却出现异常——当在三维基质中再培养，则表现为星形且迁移期间只从前到后发生极化[24]，而这种细胞几何结构及构成的变化可直接影响细胞的功能[25]。有研究表明，细胞的扁平化可有效增加表面体积(即细胞膜与细胞质)比，从而有利于信号物质从细胞表面进入内部[26]。通过在二维平面中设置“微型粘附岛”，研究者发现细胞伸展程度的变化会对细胞增殖、凋亡及分化等产生影响[27]。除了伸展的总面积，细胞的几何形状也会改变细胞的功能[28]。虽然二维培养中细胞的形貌和伸展面积会导致细胞功能的改变，但三维培养中这些因素是否对细胞的功能产生影响尚未明确[29]。事实上，三维基质中细胞的伸展或扩散很可能与二维平面上发生的过程有很大不同。

结合细胞外环境的结构多样性，不难想到三维环境中的粘附过程是高度可变的。二维培养中整合素介导的粘附过程包括：板状伪足伸展，肌球蛋白相关细胞骨架张开，粘着斑强化[30]。整个过程只需很短的时间。然而在三维环境中，细胞必须通过跨越或酶解ECM才能得到伸展，这需要数小时、甚至几天的时间方能实现，而非数分钟[31]。Doyle等[32]重现了生物来源基质上的三维粘附过程，发现二维和三维微环境中培养的细胞表面整合素类型有很大不同。有趣的是， Eyckmans等[33]发现，这种三维粘附过程可通过在具有细条形微拓扑结构的二维平面进行细胞培养而重现。

目前，对ECM粘附配体空间分布的研究仍处于起步阶段，利用二维技术研发出类似方法，可有效推动三维状态下对细胞粘附的研究[34]。Levental 等[35]发现，位于细胞底部的ECM中粘附配体的分布会影响细胞的平面极性及有丝分裂纺锤体的产生。不仅如此，研究表明ECM的纳米结构对粘附的结构、功能，甚至组成成分都有影响[36]。考虑到疾病进展过程中各种天然纳米基质结构的动态变化，对结构体系的研究就显得尤为重要[37]。

3.2 力学传导 普遍认为，力学传导在细胞间及细胞周围广泛存在，这些应力在控制细胞的结构及功能上发挥了重要的作用[38-39]。早期有研究分别将细胞置于贴壁水凝胶(固定的)中及分离的可收缩凝胶(浮动的)中进行培养，进而发现了ECM对细胞的力学作用，如乳腺上皮细胞腺泡和小管只形成于浮动的凝胶中[40]，提示三维培养可能会影响机械应力及其在细胞中的传导通路。

传统的二维培养在玻璃或塑料等材料上进行，细胞置于一种超生理硬度的静态力学环境中。在意识到人工培养环境和组织微环境之间巨大的差异后，研究者利用柔软的凝胶进行研究，发现ECM的机械硬度对细胞粘附、形态、以及干细胞分化及维持有一定影响[41]。柔软的结构特性并不是三维培养环境的固有特性，但却是三维培养体系的一种共有特点，因此在研究二维与三维培养中细胞行为的差异时，应将这个因素考虑在内。细胞感应机械硬度的具体机制仍不清楚，但目前大部分研究这种机制的方法均基于二维培养，而细胞在二维平面中感应硬度的机制与在三维微环境中不尽相同。Huebsch等[42]通过证实三维RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)海藻酸凝胶中间充质干细胞(MSC)的分化，验证了凝胶硬度对细胞行为会产生一定的影响作用，并且MSC的分化表现出双重效应，在凝胶达到一个中界硬度时骨生成发生最大化，而在二维环境中达到稳定水平。利用FRET成像系统观察细胞-ECM的相互关系，研究者同样发现，三维基质材料中骨发生需要细胞通过牵引力聚集整合素，且这种聚集在过硬的三维基质中会停止，而在二维介质中尚未发现[42]。

除了被动传感ECM的柔韧度等信号，细胞通常主动负载一些诸如力学传导和转换的信息[38]。尽管目前尚不清楚外来应力和内生力是否通过常见的机械传导通路被细胞感知[43]，但在二维和三维基质中细胞感应作用力的机制明显不同。二维培养中研究细胞的拉伸变形是在光滑和均匀的平面进行，细胞发生的形态变化是可预见的。相比之下，大部分三维基质是纤维性的，因而结构具有非均质性、各向异性[44]。作用力以何种形式传递给细胞取决于与细胞接触的基质纤维的比例和构成，以及细胞是否直接固定和或受到材料的限制。例如，位于纤维软骨内的邻近细胞，与胶原纤维的远近及粘连情况的差异也会导致伸展的程度不尽相同[45]。

3.3 效应分子的转运 营养物质、气体分子(如氧气、二氧化碳)及可溶性分子(如生长因子、激素、细胞因子)等众多的效应分子对一些基本的细胞行为，如迁移、定位、血管生成及组织结构整合等至关重要[46-48]，但在组织中这些分子的空间分布较为复杂，常由ECM的结构及孔隙率、有无血管或细胞的分布等多方面因素共同参与调节。

在传统的二维培养模式中，由细胞分泌的或外在添加的可溶性因子通过充分混合、自由扩散便可快速均衡分布。因此可在二维培养体系中研究一些短暂动态的细胞行为变化，但观察长期的、与形态变化相关的过程，则需要该培养体系中与细胞生长有关的效应分子能维持数小时甚至数天的时间。不管是通过建立三维培养体系，还是仅在二维培养平面上覆盖三维基质模拟出ECM结构，都会减慢体系中可溶性分子的转运和平衡过程，并且维持这种梯度分布的稳定，如无ECM的球状细胞团就是一种相对简单的三维模型，可捕捉一定半径内生物因子的分布梯度，而位于肿瘤细胞团中的缺氧坏死区域，被证实有利于研究氧在肿瘤形成及耐药中的作用[49]。

当细胞置身于三维微环境中，基质或支架的结构特性如孔径、纤维连接等均可调节可溶性因子的扩散[50]。通过观察μm级和mm级凝胶中肝细胞生长因子(HGF)对MDCK细胞的作用差异，研究者发现相关信号传导的时间及层面与HGF的扩散率密切相关，而与HGF所处的空间状态无关[50]。尽管体外三维培养经常忽略生物分子的扩散对细胞行为的影响，但可溶性效应因子扩散的差异有时也会引起一些意想不到的细胞行为发生。Nelson等[51]发现了一种具有抑制作用的形态因子，能够以自分泌的方式对三维μm级表皮组织中血管的出芽进行精确定位。此外，利用三维组织中氧气的分布，可准确的对细胞代谢活跃区、缺氧区甚至死亡区域进行定位[52]。

效应分子的空间分布除了受扩散因素的影响外，压力的分布梯度和大规模组织变形也可影响细胞间质的流体流动及对流运输。实际上，作用力之间的耦合和溶质的运输可能是三维环境下力学信号转换为细胞信号的另外一种重要手段[53]。除此之外，ECM还能有效隔绝可溶性因子。研究证明，硫酸肝素蛋白聚糖可与ECM中的生长因子活跃地结合，转化生长因子β也与IV型胶原的存在有着密切关系[54]。ECM中各种生物因子在时间及空间水平的储存与释放很可能是控制细胞行为的重要机制。这些因子会通过一系列机制如蛋白水解酶降解基质[55]，细胞的机械牵引等主动释放[56]，这也提示调节相关生物因子的释放至少有两条以上的信号传导途径。

4 展望

随着药物筛选和器官模型的研发，以及组织工程、再生医学的发展，在更接近体内生理状态的三维培养模型中验证二维培养体系的研究结果，将推动细胞生物学领域的发展。忽略空间的非特异性差异，深入研究培养微环境的内在作用机制，才是揭示预期结果的关键途径。未来主要研究的主题在于：细胞粘附的结构、成分及其三维分布如何改变细胞形貌、骨架结构，进而影响细胞的信号转导及相应的细胞功能；三维ECM中的力学传导如何与平面培养物或柔软的凝胶支架发生相互作用；支架或基质材料的化学及物理结构如何改变细胞生长所需各种物质的运输及利用率等。

为模拟细胞粘附、力学及化学因素对细胞功能的调节作用，三维培养过程中还会有更复杂的现象发生，而细胞对此的自然反应是结构的改变。形态变化、组织重塑和细胞迁移等行为也会改变三维组织微环境，二维培养系统中却难以重现这些过程。即便是简单的细胞行为，二维和三维状态下也有显著的差异。例如，二维基质中的细胞迁移通过几个迭代过程：前端扩展、粘连形成、发生牵引和随后尾缘的收缩。相比于这些既定的过程，细胞在三维环境中的迁移方式取决于基质的结构、成分及力学特性等[44]。因此，研究细胞迁移等过程的模型仍在不断探索中。

总之，体外细胞培养模型和天然组织环境之间不仅仅是二维平面与三维空间的差异。研究微环境中细胞粘附、力学传导及效应分子的作用机制，并明确它们在二维、三维培养时与体内相比在调节机制上的异同最为重要。这不仅有助于研究者更好地将微环境培养组织工程化，从而更准确地捕捉到细胞在体内生存的真实场景，也有助于进一步充分利用细胞功能。然而，忽略ECM是起源于细胞，只讨论细胞微环境及其对细胞行为的调控是不科学的，不管是二维还是三维培养都只是在初始条件下进行调控，还应该考虑细胞和ECM的双重关系和作用。

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