桑黄总黄酮含量及其体外抗氧化活性研究*

刘 凡，庞道睿，邹宇晓，廖森泰，肖更生

(广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东省农产品加工重点实验室，广东 广州 510610)

桑黄总黄酮含量及其体外抗氧化活性研究*

刘 凡，庞道睿，邹宇晓，廖森泰**，肖更生

(广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东省农产品加工重点实验室，广东 广州 510610)

桑黄；黄酮含量；抗氧化活性

桑黄又名桑臣、桑黄菇、桑耳等，是一种大型珍贵药用真菌，主要寄生于桑、杨、松、桦等树的树干上，在我国东北、华北、西北等地均有分布。桑黄(Phellinussp.)属于担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)、针层孔菌属(Phellinus)的真菌，具体又可以分为火木层孔菌(Igniarius)、鲍氏层孔菌(Baumii)、裂蹄层孔菌(Linteus)、瓦尼木层孔菌(Vaninii)等多个种[1]。

桑黄的药用最早记载于《本草纲目》，“利五脏，宣肠胃气，排毒气”。传统中医认为桑黄味微苦，性寒，归肝、肾经，可治疗崩漏带下，脾虚泄泻等症[2]。现代药理学研究表明，桑黄具有抗肿瘤[3]、抗氧化[4]、降血脂[5]、增强免疫力[6]等功效，是国际公认的最佳抗癌真菌之一[7]。

虽然目前对桑黄的研究主要集中在发酵条件优化[8，9]、桑黄多糖的制备及其活性研究[10-14]以及人工栽培[15]等方面。但对桑黄黄酮的研究则多集中在制备工艺优化[16-18]，关于桑黄黄酮的活性研究近年来也在逐渐兴起[19-21]。

本文以不同来源的桑黄子实体和桑黄液体发酵菌丝体为材料，测定其总黄酮含量，评价其体外抗氧化活性，分析两者相关性，并比较桑黄液体发酵菌丝体与桑黄子实体在总黄酮含量和抗氧化活性方面的差异，旨在为进一步开发和利用桑黄资源，特别是液体发酵桑黄资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生桑黄SH-1(Phellinusigniarius)，寄生于松树，购自吉林；野生桑黄SH-2(Phellinuslinteus)，寄生于桑树，购自云南；人工代料栽培桑黄SH-3(Phellinusbaumii)，购自黑龙江；人工代料栽培桑黄SH-4(Phellinusigniarius)，购自安徽；人工椴木栽培桑黄SH-5(Phellinusbaumii)，购自安徽。液体发酵培养桑黄SH-6，自行培养。桑黄菌种(Phellinusigniarius)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

种子培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)；液体发酵培养基：马铃薯浸出液30 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.2 g·L-1、酵母膏21 g·L-1、KH2PO41 g·L-1，pH自然。

总抗氧化活性(T-AOC)试剂盒、清除·OH试剂盒、清除O2-·试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司。 乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠等试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器设备

HH-4电热数字显示恒温水浴锅，上海金忠科学仪器有限公司；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备厂；DH300电热恒温培养箱，上海佳胜实验仪器有限公司；PHS-3C精密pH计，上海雷磁仪器厂；EYELA N-1100旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；UV-1700紫外分光光度计，日本岛津。

1.3 实验方法

1.3.1 桑黄菌丝体的制备

无菌条件下，用打孔器打取桑黄活化菌种块，接入含有100 mL液体培养基的三角瓶(250 mL)中，于120 r·min-1、25℃摇床培养7 d。将已生长好的菌丝转接入含有400 mL液体培养基的三角瓶(1 000 mL)，于120 r·min-1、25℃继续摇床培养10 d。将桑黄液体发酵物抽滤，取菌丝体。

1.3.2 桑黄提取物的制备

各桑黄子实体及发酵菌丝体于60℃恒温干燥，粉碎，过60目筛，备用。

称取各桑黄样品粉末1 g，加入30 mL甲醇，于40℃恒温水浴12 h后，超声(60 Hz，40℃)提取30 min，过滤，收集滤液。残渣按上述操作重复提取2次。合并滤液，40℃减压浓缩，定容到25 mL，4℃保存，备用。

1.3.3 总黄酮含量测定

桑黄提取物总黄酮含量测定采用 Al(NO3)3-NaNO2分光光度比色法测定。总黄酮含量以每克桑黄样品干物质中含有的总黄酮质量计。测定3次取平均值[22]。

1.3.4 体外抗氧化活性评价

总抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity，T-AOC)测定采用Fe3+还原试剂盒，参照试剂盒的测定方法，测定3次取其平均值，按以下公式计算其抗氧化活力(T，U·g-1)，公式为：

T=[(OD1-OD)0.01]30 ×(VV1)×N

式中：OD1表示测定管OD值；OD表示对照管OD值；V表示反应液总体积(mL)；V1表示取样量(mL)；N表示样品稀释倍数。

清除羟自由基(·OH)能力(Scavenging Hydroxyl Radical Capacity，SHRC)测定，采用Fenton反应试剂盒，参照试剂盒的测定方法，测定3次取其平均值，按以下公式计算其抗氧化活力(S，U·g-1)，公式为：

S=(OD-OD1)(OD2-OD3)×M×(1V1)×N

式中：OD表示对照管OD值；OD1表示测定管OD值；OD2表示标准管OD值；OD3表示空白管OD值；M表示标准管浓度；1表示1 mL；V1表示取样量(mL)；N表示样品稀释倍数。

S1=(OD-OD1)(OD2-OD3) ×M×1000×N

式中：OD表示对照管OD值；OD1表示测定管OD值；OD2表示标准管OD值；OD3表示空白管OD值；M表示标准管浓度；1 000的单位是mL；N表示样品稀释倍数。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 不同来源桑黄的总黄酮含量测定比较

对6种不同来源的桑黄提取物总黄酮含量进行了测定，结果如图1所示。

由图1结果可知，不同来源的桑黄总黄酮含量存在明显差异。3种人工栽培桑黄子实体的总黄酮含量比较接近，2种野生桑黄子实体的总黄酮含量存在显著差异。在所有供试样品中，桑黄SH-2的总黄酮含量最高，达到61.33 mg·g-1，而液体发酵培养的桑黄菌丝体SH-6的总黄酮含量相对较低，为27.19 mg·g-1。这可能是由于野生桑黄的生长环境差异较大，而人工培养桑黄的环境控制条件相近所造成的。此外，桑黄菌种的差异，以及子实体和菌丝体的差异，也可能是导致不同样品桑黄总黄酮含量差异的原因。

2.2 不同来源的桑黄体外抗氧化活性比较

6种供试桑黄的体外抗氧化活性测试结果如图2～图4所示。

由图2～图4结果可以看出，不同来源的桑黄，其体外抗氧化活性存在明显差异。野生桑黄子实体的体外抗氧化能力普遍较强，特别是桑黄SH-2表现尤为突出。桑黄SH-2的体外总抗氧化能力(T-AOC)和清除超氧阴离子自由基能力(SSARC)在所有供试样品中最强，分别达到589.86 U·g-1和100.44 U·g-1。清除羟自由基能力(SHRC)最强的为桑黄SH-1，达到 3 060.41 U·g-1，桑黄SH-2次之，为 2 748.64 U·g-1。综合而言，野生桑黄(SH-1、SH-2)体外抗氧化活性最强，液体发酵培养的桑黄菌丝体体外抗氧化活性相对较弱，人工代料或椴木培养的3种桑黄样品体外抗氧化活性表现相近，相互间差异不明显。

2.3 桑黄体外抗氧化活性与其总黄酮含量之间的相关性分析

采用SPSS 17.0 软件分别对桑黄体外总抗氧化能力、清除羟自由基能力、清除超氧阴离子能力与其总黄酮含量之间的相关性进行了分析，结果见表1。

注：**表示在0.01水平上(双侧)显著相关。

从表1可以看出，桑黄提取物的体外总抗氧化能力、清除羟自由基能力和清除超氧阴离子自由基能力，与其总黄酮含量之间的相关性都达到了极显著水平(p<0.01)，表明黄酮类化合物是桑黄抗氧化活性的重要物质基层。相较于抗氧化活性的测定，总黄酮含量的测定更为简便，由此认为，在鉴定桑黄药材品质时，可通过检测桑黄总黄酮含量来评价其抗氧化作用。

3 结论

桑黄是目前国际社会公认抗肿瘤效果最好的珍稀菌类之一。但由于野生桑黄受其特殊生理状态和复杂生长环境的制约，在自然界中形成的桑黄子实体很少，这使得对桑黄的研究受到了限制，也制约了桑黄产品的进一步研制和开发，远不能满足人们的需求。

通过本试验可以发现，野生桑黄在总黄酮含量及体外抗氧化活性方面具有一定优势，其活性物质含量(黄酮)及生理活性(抗氧化)均优于人工栽培及液体发酵桑黄样品。但野生桑黄资源的稀缺性注定了其研究、应用的局限性。而在供试桑黄样品中，人工栽培桑黄样品亦含有较丰富的黄酮类化合物，表现出较强的体外抗氧化活性，说明人工栽培桑黄子实体具有一定的开发潜力，可以弥补野生桑黄资源不足的缺憾。此外，液体发酵桑黄菌丝体样品虽然在总黄酮含量及体外抗氧化活性方面不如野生桑黄及人工栽培桑黄子实体，但液体深层发酵培养具有周期短、产量高、成本低等特点[23]，通过液体发酵可以快速获得大量桑黄菌丝体，可为桑黄资源的开发利用提供原料保障。

[1]张小青，戴玉成. 中国真菌志[M]. 北京：科学出版社，2005：117-191.

[2]江西新医学院. 中药大词典[M]. 上海：上海科学技术出版社，1995.

[3]DONG Wei, NING Li, LU Weidong, et al. Tumor-inhibitory and liverprotective effects ofPhellinusigniariusextracellular polysaccharides[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2009, 25(4): 633-638.

[4]LUNGM Y, TSAI JC. Antioxidant properties of polysaccharides from the willow bracket medicinal mushroom,Phellinusigniarius(L.) Quel. (Aphyllophoromycetideae) in submerged culture[J]. International Journal of Medicinal Mushrooms, 2009, 11(4): 383-394.

[5]ZOU Xiang, GUO Xia, SUN Min. pH control strategy in a shaken minibioreactor for polysaccharide production by medicinal mushroomPhellinuslinteusand its anti-hyperlipemia activity[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2009, 32(2): 277-281.

[6]谢丽源，张勇，彭卫红，等. 桑黄胞内多糖免疫及抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2011, 32(9)：276-281.

[7]吕英华，王建芳，李玉平，等. 药用真菌桑黄的研究进展[J]. 蚕业科学，2009，35 (1): 204-210.

[8]邵杰，罗建光，曾晓雄. 液体培养的桑黄胞外多糖发酵培养基成分的优化[J]. 食品科学, 2012, 33(3): 121-125.

[9]李翠翠，尉玉晓，郭立忠. 桑黄液体发酵培养基优化的初步研究[J]. 中国食用菌，2009，28(2)：46-48.

[10]郭俊平，赵述淼，马姝萍，等. 桑黄多糖抗疲劳及耐缺氧实验研究[J]. 中国食用菌，2012，31(3): 42-46.

[11]梁大勇，黄芳，赵晨，等. 桑黄粗多糖除蛋白及抗肿瘤活性[J]. 生物加工过程，2012，10(3)：56-60.

[12]孟庆龙，潘景芝，陈丽，等. 桑黄胞内及胞外多糖对荷瘤小鼠减毒增效作用的研究[J]. 中国中药杂志, 2012(6):37-41.

[13]游庆红，尹秀莲. 响应面法优化桑黄多糖提取工艺研究[J]. 中国酿造，2010(5): 67-69.

[14]Hwang HJ, Kim SW, Choi JW, et al. Production and characterization of exopolysaccharides from submerged culture ofPhellinuslinteusKCTC 6190[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2003, 33(2): 309-319.

[15]杜萍，张春凤，崔宝凯，等. 药用真菌桑黄的人工栽培技术研究[J]. 中国食用菌，2009，28(3)：35-37.

[16]包海鹰，孙德立. 桑黄黄酮提取工艺的研究[J]. 时珍国医国药，2012，23(3)：516-518.

[17]夏国华，延茹，傅海珍，等. 超声法提取桑黄总黄酮的工艺研究[J]. 江苏大学学报：医学版，2010，20(1)：40-41.

[18]胡金霞，杨焱，张劲松，等. 大孔吸附树脂纯化桑黄黄酮的研究[J]. 食品工业，2009 (3)：49-52.

[19]王钦博，杨焱，刘艳芳，等. 一年生和两年生桑黄子实体的成分和生物活性[J]. 食用菌学报，2010，17(2)：71-75.

[20]回晶，李其久，边媛媛，等. 桑黄总黄酮超声提取工艺及其生物活性研究[J]. 食品科学，2010，31(24)：195-198.

[21]汪雯翰，王钦博，张劲松，等. 鲍姆木层孔菌(桑黄)脂溶性提取物对PC12神经元细胞衰老的保护作用[J]. 菌物学报，2011，30(5)：760-766.

[22]刘善新，贾元印. 不同生长时间桑枝中黄酮成分的比较[J]. 时珍国药研究，1997，8 (1)：20-21.

[23]傅海庆，陈绍军，骆文灿，等. 桑黄菌液体发酵培养基研究[J]. 中国食品学报，2007，7 (3)：58-63.

The Total Flavone Content and in Vitro Antioxidant Activity ofPhellinussp.

LIU Fan, PANG Dao-rui, ZOU Yu-xiao, LIAO Sen-tai, XIAO Geng-sheng

(Sericulture and Farm Produce Processing Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Agro-Food science and Technology of Guangdong, GuangzhouGuangdong510610)

In order to investigate the material base of antioxidation and develop the medicinal function ofPhellinussp., the total flavone contents and in vitro total antioxidant capacity (T-AOC), scavenging hydroxyl radical capacity (SHRC) and scavenging superoxide anion radical capacity (SSARC) of extracts from six different varieties ofPhellinussp. were determined. Meanwhile, the dose-effect relationship between total flavonoid content and antioxidant activity was analyzed. The result indicated that there were significant differences among the total flavonoid contents of different varieties ofPhellinussp.. Each extract had good in vitro antioxidant activity, and the sample SH-2 was best. The correlation between total flavonoid content and T-AOC, SHRC, SSARC ofPhellinussp. reached extremely significant level (p<0.01).

Phellinus; Flavone content; Antioxidant activity

*项目来源：现代农业产业技术体系建设专项资金“桑资源加工利用岗位”(CARS-22-ZJ0502)；广东省自然科学基金博士启动项目“药用真菌桑黄抗肿瘤活性代谢产物的研究”，编号：粤科基字[2010]3号；广东省农科院院长基金“药用真菌桑黄的液体深层发酵培养及其次级代谢产物研究”，编号：201006。

刘凡(1983-)，男，助理研究员，主要从事农产品加工研究。E-mail: liufan1234@126.com

**通信作者： 廖森泰，研究员，主要从事农产品加工、蚕桑资源综合利用研究。E-mail: liaost@163.com

2014-01-18

S646.9

A

1003-8310(2014)02-0047-04