黄背木耳对正常小鼠免疫功能作用的影响*

许晓燕，余梦瑶，魏 巍，江 南，罗 霞

(四川省中医药科学院，四川 成都 610041)

〈生理生化〉

黄背木耳对正常小鼠免疫功能作用的影响*

许晓燕，余梦瑶，魏 巍，江 南，罗 霞**

(四川省中医药科学院，四川 成都 610041)

研究黄背木耳对正常小鼠免疫功能的影响。通过小鼠迟发型变态反应、ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验、血清溶血素抗体生成试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、小鼠碳粒廓清试验等方法，测定黄背木耳对正常小鼠免疫功能的影响。黄背木耳能显著有效的增强正常Balbc小鼠迟发型变态反应免疫、淋巴细胞转化能力和NK细胞活性。黄背木耳能够从细胞免疫功能方面达到增强正常小鼠免疫系统功能的作用。

黄背木耳；细胞免疫；体液免疫

黄背木耳Auriculariapolytricha，又名毛木耳、构耳、粗木耳，是热带及亚热带地区主要食用菌之一，分类学上隶属于真菌门、担子菌纲、木耳目、木耳科、木耳属[1]，已在我国范围内广泛栽种，其子实体富含碳水化合物、胶质、脑磷脂、纤维素、卵磷脂、胡萝卜素、铁、磷、维生素B1、维生素B2、维生素C等物质。黄背木耳不仅具有较高的营养价值，还具有较高的药用价值，是药食两用真菌。现代医学研究发现，黄背木耳具有活血、止血、止痛、抗肿瘤等功效[1-7]。

由于目前对黄背木耳免疫功能的系统研究较少，因此本研究从细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性等方面研究黄背木耳对正常Balbc小鼠免疫系统的作用，为黄背木耳在保健品、药品中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄背木耳子实体，购自德阳食用菌专家大院。

绵羊红细胞(SRBC)，采自健康绵阳颈静脉；鸡红细胞(CRBC)，采自健康公鸡心脏血；氧化型辅酶I，Sigma公司；一得阁墨汁，北京一得阁工贸公司；刀豆蛋白A(ConA)，Sigma公司；MTT，Sigma公司；补体4只健康豚鼠的混合血清。

1.2 仪器与设备

BSA224S电子天平，德国赛多利斯股份公司；数显游标卡尺，上海塞拓五金工具有限公司；Model 1680型酶标仪，BIO-RAD；MCO-15AC CO2培养箱，三洋电机国际贸易有限公司；WFJ7200分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黄背木耳试样的制备

黄背木耳子实体经清洗、熟化、干燥处理后，粉碎过100目筛。取黄背木耳粉末适量，加入蒸馏水，充分搅拌，使样品完全分散，静置10 min，使样品充分吸胀，用蒸馏水定容至每毫升0.075 g样品浓度的灌胃样品。

1.3.2 动物分组与给药

动物购回，基础饲料喂饲3 d后，按随机分组原则分为1 g·kg-1组、2 g·kg-1组和3 g·kg-1组和对照组。给药组以相应剂量的黄背木耳样品，对照组以灭菌水灌胃，每天上午、下午各灌胃1次，连续灌胃30 d。末次灌胃后对小鼠各项免疫功能指标进行测定。

连续灌胃30 d后，称取动物体重，颈推脱臼处死动物，取出脾脏、胸腺，分别称出脾脏、胸腺重量。计算脏器体重比值(以mg10g表示)。

1.3.4 迟发型变态反应(足跖增厚法)

在连续灌胃的第25天，每只小鼠腹腔注射2%(v·v-1)SRBC 0.2 mL免疫，继续灌胃4 d后，测量左后足跖厚度，测量3次取平均值，然后在测量部位皮下注射20%(v·v-1)SRBC，每只20 μL。注射后24 h测量左后足跖厚度，测量3次取平均值。计算攻击前后足跖厚度的差值，以差值表示小鼠足跖增厚的程度[8,9]。

1.3.5 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)

连续灌胃30 d后，颈椎脱臼处死动物，无菌取出脾脏，撕碎，过200目筛网后，用Hank’s液洗3次，用完全1640培养液配成3×106个·mL-1细胞悬液。将每份脾细胞悬液加入24孔培养板中，1 mL·孔-1，2孔份样品，1孔加75 uL ConA液(相当于7.5 μg·mL-1)，1孔作为对照，置CO2培养箱培养68 h后，取出培养板，每孔轻轻吸取0.7 mL上清液，加入0.7 μL不含小牛血清的1640培养液，以及50 μL MTT液(5 mg·mL-1)，继续培养4 h。取出培养板，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打使紫色结晶完全溶解。将溶解液移入2 mL比色杯中，在570 nm波长处测定OD值[8]。

1.3.6 血清溶血素测定(血凝法)

在连续灌胃的第25天，每只小鼠腹腔注射2%(v·v-1)SRBC 0.2 mL免疫，继续灌胃5 d后，摘除眼球取血于离心管内，放置1 h，剥离， 2 000 r·min-1离心10 min，收集血清，用生理盐水将血清作倍比稀释，每份稀释12孔，将不同稀释度的血请置于血凝板中，每孔100 μL，再加入0.5%(v·v-1)SRBC悬液100 μL，混匀，置湿盒37℃约3 h后观察结果，记录每孔的凝集程度。计算抗体积数[8，9]。

1.3.7 抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)

在连续灌胃的第25天，每只小鼠腹腔注射2%(v·v-1)SRBC 0.2 mL免疫，继续灌胃5 d后，颈椎脱臼处死小鼠，取出脾脏，撕碎，过200目筛网后，用Hank’s液洗3次，用完全1640培养液配成5×106个·mL-1细胞悬液备用。在含有0.5 mL(45℃～50℃)表层培养基的小试管中加入50 μL 10%(v·v-1)SRBC及20 μL己配好的脾细胞悬液，迅速混匀，加于挂膜玻片上，凝固后，将玻片扣放在片架上，置CO2培养箱培养1.5 h，在玻片架凹槽内加入用稀释的补体，继续培养1.5 h后，计数溶血抗体生成细胞数[8，9]。

1.3.8 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)

连续灌胃30 d后，每只小鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1 mL，30 min后，颈椎脱臼处死，将其固定在鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2 mL，转动鼠板1 min，吸出腹腔洗液1 mL，平均滴于2张载玻片上，置湿盒37℃约30 min，取出在生理盐水中漂洗、晾干、固定，4%Giemsa PBS染色3 min，蒸馏水漂洗晾干，镜检。计算吞噬百分率及吞噬指数[8]。

1.3.9 小鼠碳廓清试验

连续灌胃30 d后，技0.0l mL·g-1从小鼠尾静脉注入1∶4稀释的印度墨汁，立即计时，分别于2 min，10 min从小鼠内毗静脉从取血20 μL，加到含2 mL浓度1 mg·mL-1Na2CO3溶液的试管中，混匀，用分光光度计，在600 nm波长处测定OD值(用1 mg·mL-1Na2CO3溶液作空白对照)[8，10]。

1.3.10 NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶测定法)

连续灌胃30 d后，颈椎脱臼处死动物，取出脾脏，撕碎，过200目筛网后，用Hank′s液洗3次，用完全1640培养液配成2×106个·mL-1细胞悬液。将各只小鼠的细胞悬液取300 μL分置于96孔培养板中，每孔100 μL，每孔加靶细胞(YAC-1细胞，4×105个·mL-1)100 μL，同时做靶细胞自然释放孔(靶细胞100 μL和培养液100 μL)及最大释放孔(靶细胞100 μL和1%NP-40 100 μL各8孔，37℃、5%CO2培4 h，取出 1 500 r·min-1离心5 min。将各孔上清液100 μL置于另一培养板中，每孔再加入100 μL基质液，10 min后加1 mol·L-1HCl 30 μL终止反应，在490 nm处测定OD值。计算NK细胞活性率[8，9]。

1.3.11 统计学方法

采用SPSS18.0进行统计学分析，所有数据采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果与分析

经方差分析，F=0.2815,p=0.8384，各剂量组分别于对照组小鼠相比，其脾脏体重比值均无显著性差异(p>0.05)，见表1。

表1 黄背木耳对小鼠脏器体重比值的影响

剂量动物数∕只脾脏(mg)∕体重(10g)比值(±s)胸腺(mg)∕体重(10g)比值(±s)对照组1048.11±3.5818.77±3.351g·kg-1组1048.88±5.7318.82±2.182g·kg-1组1048.38±4.0117.41±2.663g·kg-1组1049.94±5.9919.42±3.10

经方差分析，F=0.9345,p=0.4335，各剂量组分别于对照组小鼠相比，其胸腺体重比值均无显著性差异(p>0.05)。

2.2 黄背木耳对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响

黄背木耳对小鼠DTH的影响，见表2。

注：*表示与对照组相比，p<0.05。

经方差分析，F=3.3349，p=0.0294；抗原攻击后24 h，1 g·kg-1剂量组和2 g·kg-1剂量组与对照组小鼠相比，其足跖肿胀度无显著性差异(p>0.05)；3 g·kg-1剂量组与对照组小鼠相比，其足跖肿胀度有显著性差异(p<0.05)。

2.3 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)

黄背木耳对鼠淋巴细胞转化的影响，见表3。

注：*表示与对照组相比，p<0.05。

经方差分析，F=3.1132，p=0.0374。1 g·kg-1剂量组和2 g·kg-1剂量组与对照组小鼠相比，其光密度差值均无显著性差异(p>0.05)；3 g·kg-1剂量组与对照组小鼠相比，其光密度差值有显著性差异(p<0.05)。

2.4 黄背木耳对小鼠血清溶血素产生的影响

黄背木耳对小鼠血清溶血素抗体积数的影响，见表4。

经方差分析，F=2.5437，p=0.0705。各剂量组分别与对照组小鼠相比，其抗体积数均无显著性差异(p>0.05)。

2.5 抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)

黄背木耳对小鼠抗体生成细胞的影响，见表5。

经方差分析，F=0.2079，p=0.8903。各剂量组与对照组小鼠相比，其抗体生成细胞数无显著性差异(p>0.05)。

2.6 黄背木耳对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

2.6.1 吞噬百分率

黄背木耳对小鼠腹腔区噬细胞吞噬细胞能力的影响，见表6。

经方差分析，F=1.0863，p=0.3669。各剂量组分别与对照组小鼠相比，其腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率均无显著性差异(p>0.05)。

2.6.2 吞噬指数

从表6可以看出，经方差分析，F=0.4029，p=0.7517。各剂量组分别与对照组小鼠相比，其腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬指数均无显著性差异(p>0.05)。

2.7 小鼠碳廓清实验

黄背木耳对小鼠碳廓清的影响，见表7。

经方差分析，F=0.0109，p=0.9984。各剂量组与对照组小鼠相比，其吞噬指数α无显著性差异(p>0.05)。

2.8 黄背木耳对小鼠NK细胞活性的影响

黄背木耳对小鼠NK细胞活性影响，见表8。

注：*表示与对照组相比，p<0.05。

经方差分析，F=3.3439，p=0.0291，1 g·kg-1剂量组和2 g·kg-1剂量组与对照组小鼠相比，其NK细胞活性率均无显著性差异(p>0.05)；3 g·kg-1剂量组与对照组小鼠相比，其NK细胞活性率有显著性差异(p<0.05)。

3 结论

[1]余梦瑶. 毛木耳抗肿瘤多糖组分的分离、抗肿瘤机制及不同毛木耳菌株遗传差异性研究[D]. 成都：四川大学，2008.

[2] 清源. 毛木耳的价值及开发利用现状[J]. 西昌学院学报：自然科学版，2012，26(1)：29-31.

[3] Koyama K, Akiba M, Imaizumi T. Antinociceptive constituents ofAuriculariapolytricha[J]. Planta Medica, 2002, 68(3): 284-285.

[4] 贾卫梅，何国襄，刘晶. 毛木耳对血小板凝聚作用的成分研究[J]. 中国食用菌，1991，10(2)：45-46.

[5] 许晓燕，余梦瑶，罗霞，等. 黄背木耳多糖对巨噬细胞的激活作用[J]. 中国食用菌，2008，27(3)：41-42，49.

[6]Mengyao Yu, Xiaoyan Xu, Yuan Qing, et al. Isolation of an anti-tumor polysaccharide fromAuriculariapolytricha(Jew’s ear) and its effects on macrophage activation[J]. European Food Research and Technology, 2009(228): 477-485.

[7]沈丛微，罗霞，江南，等. 毛木耳补血作用的实验研究[J]. 时珍国医国药，2012，23(7)：1674-1675.

[8]中华人民共和国卫生部. 保健食品检验与评价技术规范[M]. 北京：中华人民共和国卫生部，2003：22-34.

[9]程俊文，吴学谦，孙培虎，等. 灵芝多糖提取物胶囊对小鼠免疫功能的影响[J].中国食用菌，2009，28(6)：41-44.

[10]罗霞，郑林用，余梦瑶，等. 黄芪-乳酸菌发酵组合对小鼠免疫功能的增强作用[J]. 时珍国医国药，2012，23(4)：894-896.

The Effect ofAuriculariapolytrichaon Mice Immunological Function

XU Xiao-yan, YU Meng-yao, WEI Wei, JIANG Nan, LUO Xia

(Sichuan Academy of Chinese Medicine Science, ChengduSichuan610041)

The immunological effect of the fruit body ofAuriculariapolytrichaon mice were studied. After administration of the fruit body ofAuriculariapolytrichafor 30 days consecutively with the dose of 1 g·kg-1, 2 g·kg-1and 3 g·kg-1BW, immunological indexed were measured. Delayed anaphylactic reaction was intensified, transformation of spleen lymphocytes in the mice was increased, and the NK activity was raised. The fruit body ofAuriculariapolytrichacan strengthen the immunofunction of mice.

Auriculariapolytricha; Cellular immunity; Humoral immunity

*项目来源：国家农业产业技术体系药用菌栽培岗位建设项目,编号：农科教发[2007]12号；四川省精深加工研究岗位建设项目,编号：川农业(2009)75号；菌类药材研究与开发四川省科技创新团队，编号：2011JTD0021；四川省十二五育种攻关项目“菌类药材优质种质资源的收集及新材料的选育，编号：2011NZ0098-12-04；四川省重大科技计划项目“食药用菌现代产业链关键技术研究集成与产业化示范”，编号：2012NZ0003。

许晓燕(1980-)，女，助理研究员，研究方向为药理学。E-mail: 4086014@qq.com

**通信作者：罗霞，副研究员，研究方向为药理学。E-mail: 287748567@qq.com

2014-01-25

S646.6

A

1003-8310(2014)02-0035-04