毒蕈鉴别及毒素检测研究进展*

张黎光，李峻志，祁 鹏，李安利，戴 璐，吴小杰

(陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043)

蕈类又称蘑菇，夏秋季节我国广大地区气温较高，雨量充沛，为蘑菇等大型真菌的繁衍提供了极有利的条件。野生蕈菌是大自然赐给人类的美味佳肴，营养丰富、味道鲜美，对提高人体免疫力很有帮助，自古以来就被人们视为食用佳品。但有些野生蕈菌被人们食用后造成中毒，严重者导致死亡，人们称这类野生蕈菌为有毒野生蘑菇，即毒蘑菇 (也称毒蕈)。

毒蕈的外观与可食野生蕈菌极其相似，在野外杂生情况极难分辩，易造成人们误食中毒。近年来，我国毒蘑菇中毒的发生率呈上升趋势。据报道，因误食有毒野生蘑菇引起的中毒死亡事件已居各种中毒致死事件的第2位，而且仍不断在发生。毒蕈的毒性有强有弱，有的毒蕈毒性虽小，但进食过多仍可发生严重中毒;有的毒蕈毒性非常强，误食中毒后，一旦出现临床症状已属晚期，目前尚无特效治疗措施，抢救治疗成功率较低，死亡率高。所以毒蕈的鉴别及毒素的检测对于预防毒蕈中毒十分重要。

对于毒蕈的识别，劳动人民在长期采集和利用大型真菌的过程中已经总结积累了许多经验和方法。随着科学技术的进步，特别是真菌学发展起来以后，相关科技工作者在前人经验和研究成果的基础上，对毒蘑菇的分类、鉴别以及毒素的检测进行了一系列研究和探索，取得了较大的成果。本文对人类识别毒蕈的经验、方法或成果进行调查归纳，进而进行分析评价，这对更有效地识别毒蕈及预防中毒，进而大规模地开发利用大型野生真菌资源具有一定的实际参考价值和理论指导意义［1］。

1 毒蕈的鉴别

1.1 民间经验识别

从生境和形态上区分，可食用的无毒蘑菇多生长在清洁的草地、松树或栎树上，毒蕈则往往生长在阴暗、潮湿的肮脏地带且菌盖表面颜色鲜艳，有红、绿、墨黑、青紫等颜色，特别是紫色的蘑菇往往有剧毒，采摘后易变色。毒蕈的菌盖中央呈凸状，形状怪异，菌盖表面厚实板硬，菌环菌柄上有菌轮，菌柄多细长或粗长，易折断，毒蕈往往生有菌托。此外，毒蕈往往有怪异味，如辛辣、酸涩、恶腥等。关于毒蕈的鉴别从古至今有着各种各样的探索，民间鉴别的土办法就不少于几十种，但目前还没有1种简单、通用而有效的方法鉴别毒蕈。毒蕈的鉴别主要仍是依靠形态特征和生态习性。

1.2 真菌分类学鉴定

对生物资源的认识关键在于对物种的确定，因此，分类学鉴定法是识别毒蕈最科学、最基本的方法。利用子实体等菌丝组织体的形态结构特征，如菌盖的形状、大小、颜色、质地、菌肉、菌褶、菌盖附着物、菌盖边缘的特征;菌柄的有无、形状、长度、表面、内部以及菌环、菌托、还有孢子印、孢子、生境等特征对标本进行科学地鉴定，当标本的学名确定后，进而通过有关资料来确定其毒性特性［2］。分类方面的专著主要有《毒蘑菇》、《毒蘑菇识别》、《中国真菌志》、《中国大型真菌》、《中国大型真菌原色图鉴》、《中国大型真菌的多样性》等，国外专著有《原色日本菌类图鉴》等。真菌分类学鉴定法主要作用在于确定物种，仅适于专业人员采用，对毒蕈的识别并不是直接的。

1.3 植物检验法、动物检验法

张志光等［3］根据鹅膏毒肽抑制RNA聚合酶的活性，影响细胞mRNA的转录和蛋白质合成的原理，建立了1种以植物种子萌发试验的抑制率来鉴定、检测野生菌中是否含鹅膏毒肽的方法，称之为“抑芽法”;这种方法比较简易、快速而有效，可由于受实验条件限制，以及在没有标样的情况下，初步鉴定鹅膏菌子实体的毒素毒性与含量范围，对野外采集的标本进行毒性大小的比较和制备纯化毒素的活性检测。此外，借助于动物毒性试验，判断野生菌有无毒性，具有一定的实际价值。陈士瑜等［4］在上世纪80年代中期曾记载过利用尾草履虫鉴别毒蘑菇毒性的试验，采用此法确定了不少毒蘑菇，为毒蘑菇识别奠定了一定基础;草履虫对毒蘑菇的中毒反应与人是否一致，这一结论尚待进一步验证，可以推测，能使尾草履虫中毒的蘑菇不一定也使人中毒。也有报道采用活鱼试验是否反应敏感，具体是用一定量的新鲜蘑菇，破碎后放入养鱼水池中，半小时后观察鱼的存活状态［5］。郑颖等采用小鼠腹腔注射法可快速有效检测蘑菇是否有毒，及初步判断主要致死毒素是什么类型［6］。张志光等［7］同时采用3种方法检测灰花纹鹅膏菌对小白鼠的毒性，不仅检测出了该蘑菇具有毒性，而且通过结果对比发现该毒蘑菇既含毒肽又含毒伞肽。目前，常用于检测蘑菇毒性的供试恒温动物除了大白鼠、小白鼠外，还有猴、狗、猫等杂食或啮齿类动物，据资料记载，针对每种实验动物又有自由进食、灌胃、肌肉注射3种方法［4－8］。根据试验后动物的症状甚至死亡情况即可判断待测蘑菇是否有毒，实验研究结果表明，凡能引起某种啮齿动物或杂食动物中毒的野生菌，大多数对人体是有毒的。恒温动物试验法不仅能较为准确的鉴定蘑菇的毒性，同时还能为毒素的分析提供有力的依据。此方法虽然简单但费时，而且还受材料及其用量的限制以及不同动物对供测蘑菇敏感性的影响［9］，因此需要专门的机构或设施方能推广应用。

2 毒蕈毒素检测

2.1 化学显色检测法

毒蕈中的毒素和某些特定化学试剂有时会发生变色反应，根据这一原理，可检验某一类含特定毒素的毒蕈。这种方法准确性较高，简单易操作，但1种方法只能检验1种毒素或1种毒蕈。对于毒蕈中的其它毒素或其它种毒蕈则不能鉴别。因此不能作为鉴别的主要方法，只能作为辅助手段。以下简单介绍几种毒蕈中有毒成分分离与检测［10－19］。

毒肽和毒伞肽:含有鹅膏肽类毒素的蘑菇主要有鹅膏属Amanita、盔孢伞属Galerina和环柄菇属Lepiota中的一些种类，在鹅膏菌属中，主要有毒鹅膏菌 (Amanita phalloides)、白毒鹅膏菌 (A.verna)、鳞柄白毒鹅膏菌 (A.virosa)、双孢鹅 膏 菌 (A.bisporigera)、 赭 鹅 膏 菌 (A.ocreata)、A.suballiacea、A.tenuifolia、A.bygroscopia 等;在盔孢伞属中，主要有秋盔孢伞 (Galerinaautumnalis)、毒盔孢伞(G.venenata)、单色盔孢伞 (G.unicolor)、G.marginata、G.beinthii等;在环柄菇属中，主要有褐鳞环柄菇 (Lepiota helveola)、栗色环柄菇 (L.castanea)、肉褐鳞环柄菇(L.brunneoincarnata)、L.josserandi、L.heteri、L.scobinella 等。目前，国内外主要采用V.E Tyler方法进行毒肽类检测，采用甲醇提取分离后，用硅胶 G作吸附剂，用氯仿和无水乙醇(19∶1，v·v－1)展开，用桂皮醛作显色剂，前者为蓝色斑点，后者为紫色斑点。此外，Meixnes介绍了1种简易检测毒伞肽的方法，其原理是以毒伞肽同复杂的生物聚合物即木质素酸化反应为基础，形成1种蓝色的产物。具体试验是将新鲜毒蕈捣烂后汁液滴在1张白报纸上，待干后，再滴浓盐酸，阳性为蓝色斑点，而毒肽与木质素不产生此反应，因此无蓝色斑点出现。本法适合中毒现场检测。

生物碱类:据报道野生毒蕈中普遍存在生物碱，其检出率高达90%。目前国内主要采用雷氏盐或 Stas－otto's方法进行分离，采用纸层析和薄层析进行定性。薄层一般用硅胶G板，用氯仿、环已烷和甲醇 (75∶15∶10，v·v－1)展开，喷Drugendorff显示剂，阳性为桔红色斑点。据Broum报告，胆碱、乙酰胆碱和毒蕈碱的 RF值分别为0.09、0.22和0.28，由于在碱性条件下乙酰胆碱水解，故不干扰毒蕈碱检测。有条件的话，将生物碱提取分离后，经纯化、重结晶后作生物碱的沉淀和显色反应、熔点或光谱分析，测定其分子量、化学结构和元素组成，进而确定为何种生物碱。

蟾蜍素:鹅膏菌属中的毒蝇鹅膏菌 (Amanita muscaria)、褐 云 斑 鹅 膏 菌 (A.porphyria)、 豹 斑 毒 鹅 膏 菌(A.pantherina)、橙黄鹅膏菌 (A.citrina)以及橘黄裸伞(Gymnopilus sepctabilis)等毒蕈含有蟾蜍素。该毒素采用甲醇提取分离后，用硅胶G作吸附剂，用醋酸乙酯、异丙醇和25%氨水 (45∶35∶20，v·v－1)展开，用 2，4—二硝基苯肼或对二甲氨基苯醛显色，分别显紫红色或蓝色为阳性反应。

5－羟色胺及5－羟色氨酸:在紧缩斑褶菌 (Panaeolus sphinctrinus)中发现此类毒素。检材采用甲醇提取分离后，用硅胶G作吸附剂，用氯仿和5%甲醇 (浓氨水饱和)展开，用对二甲氨基苯甲醛显色，显2个紫色斑点为阳性。

光盖伞素及光盖伞辛:存在于墨西哥裸盖伞 (Psilocybe mexicana)、古巴裸盖伞 (P.cubensis)、日本裸盖伞、网纹斑褶菇 (Panaeolus retirugis)、钟形斑褶菇 (P.campanulatus)等毒蕈中。该毒素采用甲醇提取分离，常用的有3种不同类型的层析板，即硅胶板、纤维素板和氧化铝板。先点上标样，再点上蘑菇提取液，用丁醇、乙酸和水 (12∶3∶5，v·v－1)作分离相，干燥后置紫外灯下初步观察。为了显色清楚还要配制临时试剂，硅胶板用Ehrlich’s试剂 (10%的对二甲胺苯醛溶于浓盐酸中与丙酮按1∶4配成溶液)，纤维素板和氧化铝板用20%纯无水对甲苯磺酸溶于甲醇溶液。用纸巾包裹层析板，淋上不同试剂，放置通宵后第2天观察，结果光盖伞素呈红褐色至紫褐色，光盖伞辛呈紫黑色，它们各有不同的RF值。此法简单易行，可快速定性检测蘑菇子实体是否含有裸盖菇素类毒素［20］。

奥来毒素:含此毒素的毒蕈主要是丝膜菌属Cortinarius的一些种类。其中细鳞丝膜菌 (Cortinarius speciosissimus)和C.splendens在我国有分布。1983年Schumacher和Hoiland提出1种快速定性检测蘑菇子实体中是否含有奥来毒素的方法，即取新鲜或干的蘑菇放在5倍体积的水里研磨，室温下静置10 min后过滤，然后在滤液中加入等体积的3%的FeCl3·6H2O(溶解在0.5 moL HCl中)，如出现蓝黑色即表明该蘑菇中含有奥来毒素［21］。这一方法可用于出现中毒后，直接检测吃剩的蘑菇或呕吐物确认是否误食含奥来毒素蘑菇，以便迅速确定有效可行的治疗方法。也适用于野外采集时的初步鉴定。

此外还有报道，用氢氧化钾可识别鳞柄白毒鹅膏菌 (变金黄色)，用硫酸可识别出毒鹅膏菌 (变青紫色)和豹斑毒鹅膏菌 (变橙黄色)［1］。

2.2 高效液相色谱法

据部分地区不完全统计，误食野生蕈菌的中毒事件中，95%以上都是由鹅膏菌所致［22］。高效液相色谱 (HPLC)的发展与应用，使鹅膏菌毒素研究与开发进入了一个新的阶段，现在商品化的鹅膏菌毒素都是由HPLC法分离纯化的。首先应用HPLC进行毒素研究的是Beutler和Der marderosian，之后Pastorello等、En Jalbert F.等、Hampl J等都相继研究了鹅膏菌毒素检测分离技术，该法分离生物样品具有速度快、灵敏度高、分辨率好、用量少等优点。我国学者张秀尧等［23］在此基础上建立了同时快速检测尿液和血浆中3种鹅膏毒肽、2种鬼笔毒肽的超高效液相色谱三重四极杆质谱联用分析方法。柳洁等［24］采用超高效液相色谱－电喷雾离子化－四级杆飞行时间串联质谱技术 (UPLC－ESI－Q－TOF)，建立了野生菌样品中α－鹅膏毒肽、β－鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽4种毒素特征信息的高分辨质谱指纹图谱和分析鉴定方法;该方法快速、准确、选择性好、特异性强，为毒素的定性确证提供了1种可靠方法，同时也满足对样品中毒素含量的定量测定要求，适用于突发毒蕈中毒事件的毒素确证分析。

3 总结与展望

综上所述，误食毒蕈中毒给人类带来极大的危害。关于毒蕈识别与鉴定，民间简易识别方法可用来区别某种毒蕈，但不能作为鉴别毒蕈通用方法;毒素化学检测方法有些较繁琐，加之不少的毒素不稳定，故不能完全作为可食蘑菇与毒蕈鉴别的方法。因此认为，在目前比较科学和切实可行的方法应是从分类学上认识毒蕈的种类，通过形态特征和生态习性等生物学性状观察，尤其是担孢子形状、颜色、大小、花纹等，辅以生物学方法，并结合相关毒性试验和化学检验加以鉴别。各级相关部门应加强有关毒蕈知识的宣传，提高人们对毒菌中毒危害性的认识，在采摘野生蕈菌食用时要慎之又慎，尽可能避免误食中毒事件的发生。

毒性物质动力学研究发现，对各类生物样品中毒肽的检测还受时间限制。为了预防毒蕈中毒，毒蕈毒素的快速鉴别检测技术理应成为以后重要的研究方向。目前针对神经致幻毒蕈已有人进行了这方面的应用尝试，即改良比色法检测色胺类物质及定性检测试纸的研制［25，26］。新型、灵敏、快速的分析方法如高效液相色谱、核磁共振、质谱、紫外－红外检测等现代检测手段为研究毒蕈不同组织和不同生化样品中毒素种类及含量提供了可能。病人的血浆、尿液、胆汁等都可以作为检测对象，这对临床治疗及毒素的基础研究具有现实意义。随着技术的发展，到目前为止，可以同时分离鉴定多种毒素，并适时监控，被检测样品范围及检测灵敏度也提高了很多。对分离到的毒性物质还可以借助质谱等技术加以结构分析，进一步对其毒性做出分子水平的解释。然而该领域目前仍属于基础性研究，开发利用毒蕈涉及较广泛的学科领域，由于条件所限，开展的研究也比较肤浅，有待于进一步深入研究，尤其是针对毒性机理和药理活性的研究等方面还需做大量工作。

［1］朱元珍，张辉仁，祝英，等.古今毒蘑菇识别方法评价［J］.甘肃科学学报，2008，20(4):40－44.

［2］张树溪，王春娥，刘加吾，等.毒簟的识别与鉴定［J］.实用预防医学，1999，6(5):3893－3894.

［3］张志光，刘建强，张晓元，等.一种简便、快速测定鹅膏多肽毒素的方法 －抑芽法 ［J］.菌物系统，2001，20(3):381－386.

［4］陈士瑜.“蘑菇人”的悲剧与毒菌鉴别 ［J］.食用菌，1986，3(6):41－42.

［5］中科院微生物所真菌组.毒蘑菇［M］.北京:科学出版社，1975:48

［6］郑颖，范泉水，余芳芳，等.动物实验快速诊断有毒蘑菇的方法［A］.第八届中国生物毒素学术研讨会论文摘要集［C］.2007.

［7］卯晓岚.毒蘑菇及其毒性［J］.中国预防医学杂志，1980，14(3):188－192.

［8］张松.食用菌学［M］.广州:华南理工大学出版社，2000:62－65.

［9］谭铭雄，李宽银，马林，等.一起误食毒蕈导致8人死亡的食物中毒调查 ［J］.华南预防学，2002，28(2):51－52.

［10］Benjamin DR.Mushrooms:poisons and panaceas，a handbook for Naturalists，Mycologists，and Physicians［M］.New York:W.H.Freeman and Company，1995.

［11］Spoerke DG，Rumack BH.Handbook of mushroom poisoning:diagnosis and treatment［M］.Boca Raton:CRC Press，1994.

［12］日本药学会.日本卫生试验注解 ［M］.北京:华文出版社，1995:349－355.

［13］张树溪，臧雪冰，李建国，等.湖南省毒菌生物学特性及其中毒防治的研究［J］.实用预防医学，1994，1(3):170－171.

［14］张树溪，臧雪冰，彭建岩，等.秋生盔孢伞中毒调查报告［J］.湖南预防医学杂志，1992，4(3):164.

［15］张树溪，易再明，臧雪冰，等.一起紫孢侧耳中毒调查报告［J］.实用预防医学，1997，4(2):112.

［16］Guzman G，Allen JW，Gartz J.A world wide geographical distribution of the neurtropic fungi，an analysis and discussion ［J］.Ann.Mus.Civ.Rovereto Sez，1998(14):189－280.

［17］贺新生.中国斑褶菇属 (Panaeolus)物种记录 ［J］.食用菌，2001(5):3－4.

［18］唐侠民，吴永兰，周玲，等.毒蘑菇中毒肽与毒伞肽检验方法的探讨［C］//食品卫生理化检验文集.北京:北京大学出版社，1990:37.

［19］张树溪，臧雪冰，李建国，等.亚稀褶黑菇毒性物质研究报告［C］//全国第三次卫生检验学术交流会论文集 (卫生化学部分).北京:中华预防医学会，1986:16.

［20］Michael WB，Jeremy B.Quantitative analysis of psilocybin and psilocin in Psilocybe baeoeystis by HPLC and TLC ［J］.Chromatography，1981(207):379－385.

［21］Schumacher TK，Hoiland K.Mushroom poisoning caused by species of the genus Cortinarius(Fries)［J］.Archives of Toxicology，1983(53):87－107.

［22］王建东.蕈菌的出菇培养及α－鹅膏毒肽的分离纯化［D］.成都:四川大学，2004.

［23］张秀尧，蔡欣欣.超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法快速检测尿液和血浆中鹅膏毒肽和鬼笔毒肽 ［J］.分析化学，2010，10(1):39－44.

［24］柳洁，丁文婕，何碧英，等.超高效液相色谱－电喷雾离子化－四级杆飞行时间串联质谱指纹图谱检测毒蕈中4种鹅膏肽类毒素 ［J］.分析化学，2013，41(4):500－508.

［25］何培新，郭恒，何冬旭，等.改良比色法在神经致幻型毒菌活性色胺类物质检测中的应用［J］.菌物研究，2006，4(1):24－28.

［26］何冬旭，何培新，张长铠.神经致幻型毒菌活性色胺类物质定性检测试纸的研制与应用［J］.食用菌，2006，28(2):46－47.