红细胞（微）嵌合体血型鉴定新方法的建立及初步应用

孙 禾 谢作听 俞石芳

（温州医科大学附属第一医院，浙江温州 325000）

·临床与检验·

红细胞（微）嵌合体血型鉴定新方法的建立及初步应用

孙 禾 谢作听 俞石芳

（温州医科大学附属第一医院，浙江温州 325000）

目的建立红细胞（微）嵌合体血型鉴定的新方法并对其进行初步应用。方法建立4℃吸收56℃放散盐水介质试管法用于检测A／O、B／O体外模拟红细胞微嵌合体和ABO血型不合异基因造血干细胞移植后患者红细胞微嵌合体血型，同时将其与常规盐水介质试管法结果进行对比分析。结果4℃吸收56℃放散盐水介质法A／O嵌合体模型组中A型红细胞、B／O嵌合体模型组中B型红细胞最低检测限均为1∶12800，ABO血型不合异基因造血干细胞移植后患者标本检到B抗原；常规盐水介质试管法A／O嵌合体模型组中A型红细胞以及B／O嵌合体模型组中B型红细胞最低检测限均为1∶100，ABO血型不合异基因造血干细胞移植后患者未检到B抗原。结论4℃吸收56℃放散盐水介质试管法对红细胞（微）嵌合体血型的最低检测限明显小于常规盐水介质试管法，可用于ABO血型不合异基因造血干细胞移植后红细胞血型的动态监测。

红细胞；微嵌合体；血型鉴定

ABO血型不合异基因造血干细胞移植（allo－HSCT）后，患者体内可形成ABO血型红细胞（微）嵌合体，由于嵌合体的动态变化与造血干细胞移植后患者病情的发展是相关的，因此定期监测嵌合体是评估患者预后和选择针对性治疗策略的重要依据［1］，有助于临床更好了解移植效果［2－3］。常规盐水介质试管法是检测红细胞嵌合体的常用方法之一，但由于其检测灵敏度较低［4－5］，故该法并不适用于红细胞微嵌合体的检测。为此，本文建立了4℃吸收56℃放散盐水介质试管法并用于红细胞微嵌合体检测，取得令人满意的结果，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 观察组 收集2013年7月2日入住本院ABO血型不合异基因造血干细胞移植后1例患儿，男，7岁，因急性单核细胞白血病于4个月前行同胞异基因造血干细胞移植术（A供AB）；当前血型血清学检测结果ABO正定型A型，反定型AB型，抗体筛查试验结果阴性。

1.1.2 嵌合体模型组 另随机收集多人混合A型健康献血员洗涤后血细胞比容10mL（由10份A型 RhD阳性供血者洗涤后血细胞比容等量混合而成，以下简称混合A型红细胞）、多人混合B型健康献血员洗涤后血细胞比容10mL（由10份B型RhD阳性供血者洗涤后血细胞比容等量混合而成，以下简称混合B型红细胞）、多人混合O型健康献血员洗涤后血细胞比容40mL（由40份O型RhD阳性供血者洗涤后血细胞比容等量混合而成，以下简称混合O型红细胞）。

1.2 试剂与仪器 抗A、抗B定型试剂（上海血液生物医药有限责任公司，批号20121121，效价均为512），A、B、O型健康献血员红细胞（本室自制），CU－420电热恒温水箱（上海齐欣科学仪器有限公司）、Baso2005－2离心机（台湾Baso公司），Olympus普通光学显微镜（日本欧林巴斯公司）。

1.3 微嵌合体模型的构建 （1）A／O微嵌合体：取10支试管，排成1排，依次对应加入20%、10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%、0.15625%、0.078125%、0.0390625%混合A型悬液50μL，然后每管加入混合O型红细胞悬液0.5mL，混匀，即可得到1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600 10种A／O嵌合体模型；（2）B／O微嵌合体：取10支试管，排成1排，依次对应加入20%、10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%、0.15625%、0.078125%、0.0390625%混合B型红细胞悬液50μL，然后每管加入混合O型红细胞悬液0.5mL，混匀，即可得到1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600 10种B／O嵌合体模型。

1.4 4℃吸收56℃放散盐水介质法 （1）A／O嵌合体模型组：上述10种A／O嵌合体模型管中分别加入抗A定型试剂0.5mL，混匀，于4℃吸收2小时（期间每隔15分钟轻轻摇匀1次），用9g／L NaCl溶液洗涤4次，末次洗涤后弃上清，分别加入9g／L NaCl溶液0.5mL，混匀，于56℃水浴箱内释放15分钟（期间不时轻轻摇晃），立即离心后吸取上层释放液，等分为2份，分别加入3%混合A型红细胞、3%混合O型红细胞50μL，混匀，1000rpm离心1分钟后肉眼或显微镜观察结果（肉眼未见凝集者以显微镜结果为准）；（2）B／O嵌合体模型组：上述10种B／O嵌合体模型管分别加入抗B定型试剂0.5mL，混匀，于4℃吸收2小时（期间每隔15分钟轻轻摇匀1次），用9g／L NaCl溶液洗涤4次，末次洗涤后弃上清，分别加入9g／L NaCl溶液0.5mL，混匀，于56℃水浴箱内释放15分钟（期间不时轻轻摇晃），立即离心后吸取上层释放液，等分为2份，分别加入3%混合B型红细胞、3%混合O型红细胞50μL，余操作同A／O嵌合体模型组；（3）观察组：分别加入患者洗涤后血细胞比容和抗B定型试剂各0.5 mL，混匀，余操作同B／O嵌合体模型组。判断标准：若释放液与混合O型红细胞反应不出现肉眼和显微镜下凝集现象，而与混合A（或B）型红细胞反应出现肉眼或显微镜下凝集现象，则判为检到A（或B）抗原；若释放液与混合A（或B）、O型红细胞反应均不出现肉眼和显微镜下凝集现象，则判为未检到A（或B）抗原；（4）重复性试验：上述试验A／O嵌合体模型组、B／O嵌合体模型组同时进行10份测定，观察组因标本量限制，只做双份测定。

1.5 常规盐水介质试管法 严格按照试剂说明书操作，具体操作如下：（1）A／O嵌合体模型组：分别加入3%A／O嵌合体红细胞悬液和抗A定型试剂各1滴（50μL），混匀，1000rpm离心1分钟后肉眼或显微镜观察结果（肉眼未见凝集者以显微镜结果为准）；同时设立盐水自身对照；（2）B／O嵌合体模型组：分别加入3%B／O嵌合体红细胞悬液和抗B定型试剂各1滴（50μL），余操作同A／O嵌合体模型组；（3）观察组：分别加入3%患者红细胞悬液和抗B定型试剂各1滴（50μL），余操作同A／O嵌合体模型组。判断标准：若待检红细胞盐水自身对照不出现凝集现象，而与抗A（或抗B）定型试剂出现凝集现象，则判为检到A（或B）抗原；若待检红细胞与抗A（或抗B）定型试剂不出现凝集现象且盐水自身对照结果阴性，则判为未检到A（或B）抗原。

2 结 果

2.1 重复性试验评价 A／O嵌合体模型组、B／O嵌合体模型组10次结果完全一致，最低检测限均为1∶12800；观察组两次结果一致。

2.2 特异性试验评价 A／O嵌合体模型组、B／O嵌合体模型组放散液与3%O型红细胞反应的对照组试验均不出现凝集，可排除非特异性凝集可能。

2.3 检测灵敏度 4℃吸收56℃放散盐水介质法A／O嵌合体模型组中A型红细胞、B／O嵌合体模型组中B型红细胞最低检测限均为1∶12800，ABO血型不合异基因造血干细胞移植后患者标本检到B抗原；常规盐水介质试管法A／O嵌合体模型组中A型红细胞、B／O嵌合体模型组中B型红细胞最低检测限均为1∶100，ABO血型不合异基因造血干细胞移植后患者标本未检到B抗原。

3 讨 论

ABO不合异基因造血干细胞植入后到疾病复发，通常要经历以下几个嵌合状态：（1）供者红细胞微嵌合（供者红细胞比例＜1%）；（2）供、受者混合红细胞嵌合（供者红细胞比例介于5%～95%）；（3）完全供者红细胞嵌合（供者红细胞比例为100%）；（4）供、受者混合红细胞微嵌合（受者红细胞比例＜1%）；（5）供、受者混合红细胞嵌合（受者红细胞比例介于5%～95%）；（6）完全受者红细胞嵌合（受者红细胞比例为100%）。由于供、受者混合红细胞微嵌合和混合红细胞嵌合既可能向完全的供者红细胞嵌合方向转变（预示移植成功），也可能向完全受者红细胞嵌合的方向发展（预示移植失败或疾病复发），故对移植后患者开展红细胞（微）嵌合体的动态监测对移植后患者转归的判断以及临床干预措施的选择具有重要的临床意义。

吸收放散试验是一种敏感、实用的血型血清学技术，目前主要用于红细胞血型抗体纯化、分离、鉴定以及红细胞弱抗原的检测分析。吸收是用红细胞（抗原）在最适条件下充分吸收目标抗体，放散则是将吸附于红细胞上的抗体用物理或化学的方法使其脱离下来，然后再采用指示红细胞来反映试验结果。吸收放散试验的主要目的是浓缩、纯化抗体，最终达到提高检测灵敏性和特异性（减少非特异性干扰）的目的。根据抗原抗体的特性不同，可选择相应的吸收放散方法。因A、B抗原与抗A、抗B IgM的最适吸收放散条件为4℃吸收56℃放散，故本文建立4℃吸收56℃放散盐水介质法检测红细胞ABO血型（微）嵌合体。

本文结果显示，建立的4℃吸收56℃放散盐水介质试管法的最低检测限均为1∶12800，可检测受者或供者红细胞构成比＞0.01%的微嵌合体，而常规盐水介质试管法的最低检测限为1∶100（1%），只能检测受者或供者红细胞构成比＞1%的嵌合体，因此，4℃吸收56℃放散盐水介质试管法检测灵敏度明显高于常规盐水介质试管法。David等［4］和翟菊萍等［6］曾采用流式细胞仪检测异基因造血干细胞移植患者红细胞嵌合体，并指出流式细胞术可检测受者或供者红细胞构成比＞0.4%的微嵌合体。4℃吸收56℃放散盐水介质试管法与流式细胞仪法对微嵌合体的检测能力的比较有待进一步研究。

综上所述，流式细胞术虽然较稳定，但其价格昂贵，不适合临床常规开展。4℃吸收56℃放散盐水介质试管法有较小最低检测限，灵敏度较高，重复性较好，如能对每次参与吸收放散的细胞量和抗体量作定量规定，制定严格操作规程，可基本消除主观因素影响，用于ABO不合异基因造血干细胞植患者移植后（微）嵌合体血型的早动态监测，亦可获较满意结果，值得临床进一步推广应用。

［1］李归宁，刘峰，胡丽华．造血干细胞移植后嵌合体分析的研究．临床血液学杂志，2010，23（8）：502

［2］Bader P，Klingebiel T，Schaudt A，et al．Prevention of relapse in pediatric patients with acute leukemias and MDS after allogeneic SCT by early immunotherapy initiated on the basis of increasing mixed chimerism：a single center experience of 12 children．Leukemia，1999，13：2079

［3］Xiaowen Tang，Gheath Alatrash，Jing Ning，et al．Increasing Chimerism after Allogeneic Stem Cell Transplantation Is Associated with Longer Survival Time．Biol Blood Marrow Transplant，2014，20：1139

［4］David B，Bernard D，Navenot JM，et al．Flow cytometric monitoring of red blood cell chimerism after bone marrow transplantation．Transfus Med，1999，9：209

［5］Hendriks EC，de Man AJ，van Berkel YC，et al．Flow cytometric method for the routine follow－up of red cell populations after bone marrow transplantation．Br J Haematol，1997，97：141

［6］翟菊萍，顾国浩，王雪明，等．红细胞嵌合体定量检测及在异基因造血干细胞移植中的应用．临床检验杂志，2011，29（3）：188