SPARC在肝癌细胞中负性调控糖酵解作用的研究

华红伟 姜峰 胡薇薇 李静 丁罡,

(1.上海交通大学医学院附属新华医院，上海 200092；2.上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院，上海 202150；3.上海市崇明新华癌痛转化研究所，上海 202150)

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界第三大癌症死亡原因[1]，HCC患者的5年生存率仅18%[2]。HCC的发生机制一直是国内外的研究热点。分泌性富含半胱氨酸的酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)是细胞外基质非胶原糖蛋白中的一种钙结合蛋白，也称骨连接蛋白(osteonectin)、基底膜-40(BM-40)、43k蛋白，由Termine等[3]在1981年发现。SPARC参与细胞的黏附和迁移、细胞周期的调控、血管的生成和增殖、组织的更新和修复等多种生理过程。本研究探讨了SPARC在HCC中的表达与糖酵解作用的关系，以期为HCC发生发展的机制研究提供新的思路和实验依据。

1 资料与方法

1.1 细胞及细胞培养 人HCC细胞株HepG2购自美国菌种保藏中心细胞库(American Type Culture Collection，ATCC)。培养条件：应用含10%胎牛血清及青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液，置于CO2体积分数为5%、37.5 ℃、饱和湿度的培养箱中培养。

1.2 试剂 SPARC质粒及SPARC siRNA购自北京傲锐东源生物科技有限公司；β-actin小鼠单抗购自美国Cell Signaling Technology公司；Oligofectamine、Opti-MEM I低血清培养基购自美国Invitrogen公司；葡萄糖/葡萄糖氧化酶检测试剂盒购自美国Molecular Probes公司；乳酸检测试剂盒购自美国Biovision公司。

1.3 方法

1.3.1 SPARC质粒/SPARC siRNA的转染 转染前1 d，取出处于对数生长期的HepG2细胞，以每孔(3～5)×105细胞的密度接种于6孔培养板，当细胞融合率在70%～80%时即可进行转染实验；将SPARC质粒、SPARC siRNA加入不含血清的Opti-MEM I培养基，共100 μL，轻轻摇匀；以Oligofectamine作为转染载体，SPARC质粒/SPARC siRNA(μg)和Oligofectamine(μL)的比例为1∶2，用Opti-MEM I低血清培养基稀释至100 μL，在室温下孵育5 min；将稀释后的SPARC质粒/SPARC siRNA与稀释后的Oligofectamine混合(共200 μL)，在室温下孵育30 min后，加入细胞培养皿中，在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱孵育24 h。24 h后，换用正常培养液，继续培养24 h后收集细胞，评估转染效率。

1.3.2 采用比色法检测葡萄糖摄取量 将细胞以每孔(1～3)×105的密度接种于12孔培养板；培养48 h后收集培养液，检测前置于-20 ℃；采用葡萄糖/葡萄糖氧化酶检测试剂盒，检测高速离心后上清液中的总蛋白浓度，绘制标准曲线，测定总蛋白浓度；应用酶标仪在563 nm波长处测定吸光度值。

1.3.3 采用比色法检测乳酸生成量 检测前1 d，将细胞以每孔2×105的密度接种于24孔培养板；去除培养液，用磷酸盐缓冲液漂洗细胞2次，将细胞培养板用多孔板离心机以400 r/min离心5 min，吸去上清液；按照乳酸检测试剂盒说明书加入样本、酶工作液及显色剂，漩涡混匀，37 ℃孵育10 min，然后加入终止剂终止反应；在530 nm波长处测定吸光度值。

1.4 统计学处理 采用SPSS 15.0软件进行统计学处理，采用非配对t检验分析结果。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

转染SPARC质粒的HepG2细胞的葡萄糖摄取量较对照组明显下降，吸光度由(100.00±4.80)%降低至(61.20±4.07)%，差异有统计学意义(P<0.05)；转染SPARC siRNA后的HepG2细胞的葡萄糖摄取量较对照组明显增加，吸光度由(100.00±8.20)%上升至(157.60±4.80)%，差异有统计学意义(P<0.05)。

转染SPARC质粒的HepG2细胞的乳酸生成量较对照组明显下降，吸光度由(100.00±5.20)%降低至(64.63±4.18)%，差异有统计学意义(P<0.05)；转染SPARC siRNA后的HepG2细胞的乳酸生成量较对照组明显增加，吸光度由(100.00±8.30)%上升至(175.26±5.46)%，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

糖酵解是细胞能量代谢的重要途径之一。恶性肿瘤细胞即使氧气供应充分，但获取能量还主要靠有氧糖酵解，以满足自身快速增殖的需要，肿瘤细胞这种活跃的有氧糖酵解特性被称为Warburg效应[4]。通过抑制糖酵解而阻断肿瘤细胞的能量来源，以抑制肿瘤生长，这是近年研究的一个热点。

SPARC具有多种生物学特性。研究[5]发现，SPARC与恶性肿瘤的大小、病理类型、侵袭度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期有关。但是，目前关于SPARC在原发性HCC中的研究较少，其作用及相关机制尚不明了；关于SPARC与恶性肿瘤糖酵解过程的关系鲜见报道。

本研究以人HCC细胞株HepG2为研究对象，探讨SPARC在HCC中的表达与糖酵解过程的关系。乳酸是糖酵解过程的最终产物，恶性肿瘤细胞糖酵解活跃，故产生的乳酸也相应增加。因此，本研究分别将SPARC质粒及SPARC siRNA稳定转染入HepG2细胞后，采用比色法观察细胞葡萄糖摄取量和乳酸生成量的变化。结果显示，转染SPARC质粒的细胞的葡萄糖摄取量及乳酸生成量明显下降；转染SPARC siRNA后，细胞的糖酵解作用较对照组明显增强，提示SPARC在HCC细胞的糖代谢过程中具有重要作用。本研究结果提示，HCC中SPARC可能是一种肿瘤抑制物，这与Atorrasagasti等[6]的研究结果相似；SPARC可能通过抑制糖酵解过程而抑制肿瘤的发生与发展，这为HCC的复发转移途径的研究提供了新的思路。但是，也有研究[7]报告，SPARC在HCC的基质中呈高表达水平，并与HCC的恶性程度有关。因此，关于SPARC在HCC中的作用，尚待进一步探究。

综上所述，SPARC可能具有抑制HCC发生发展的生物学功能，可能通过抑制糖酵解作用而阻止肿瘤细胞的生长与增殖，但其在不同类型的HCC细胞中的功能及相关作用机制尚待深入研究。

[1]El-Serag HB.Hepatocellular carcinoma[J].N Engl J Med,2011,365(12):1118-1127.

[2]Altekruse SF,McGlynn KA,Dickie LA,et al.Hepatocellular carcinoma confirmation,treatment,and survival in surveillance,epidemiology,and end results registries,1992-2008[J].Hepatology,2012,55(2):476-482.

[3]Termine JD,Kleinman HK,Whitson SW,et al.Osteonectin,a bone-specific protein linking mineral to collagen[J].Cell,1981,26(1 Pt 1):99-105.

[4]Warburg O.On the origin of cancer cells[J].Science,1956,123(3191):309-314.

[5]Wang L,Yang M,Shan L,et al.The role of SPARC protein expression in the progress of gastric cancer[J].Pathol Oncol Res,2012,18(3):697-702.

[6]Atorrasagasti C,Malvicini M,Aquino JB,et al.Overexpression of SPARC obliterates the in vivo tumorigenicity of human hepatocellular carcinoma cells[J].Int J Cancer,2010,126(11):2726-2740.

[7]Ledda F,Bravo AI,Adris S,et al.The expression of the secreted protein acidic and rich in cysteine(SPARC) is associated with the neoplastic progression of human melanoma[J].J Invest Dermatol,1997,108(2):210-214.