缝隙连接细胞间通讯与肝细胞癌关系的研究进展

赵宇 综述 杨燕张凯审校

作者单位：233004 安徽蚌埠 蚌埠医学院第一附属医院1肿瘤内科，2口腔科；蚌埠医学院研究生部

综述

缝隙连接细胞间通讯与肝细胞癌关系的研究进展

赵宇 综述 杨燕1张凯2审校

作者单位：233004 安徽蚌埠 蚌埠医学院第一附属医院1肿瘤内科，2口腔科；蚌埠医学院研究生部

缝隙连接（gap junction，GJ）是相邻细胞之间由缝隙连接蛋白（connexin，Cx）组成的一种特殊膜结构，小分子物质通过GJ在相邻细胞间进行物质和能量的直接交换现象称为缝隙连接细胞间通讯（gap junctional intercellular communication，GJIC）。研究证明GJIC功能的异常与肿瘤，包括肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发生、发展关系密切。本文拟对GJIC与HCC的关系，以及GJIC作为HCC治疗新靶点的潜在价值作一综述。

肝肿瘤；缝隙连接蛋白；缝隙连接细胞间通讯；治疗靶点

原发性肝癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，其中90%以上是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。全球癌症发病率中，HCC居于第6位，死亡高居第3位［1］。我国是全球HCC发病和死亡人数最多的国家，且呈逐年上升趋势［2］。攻克HCC成为亟待解决的重大课题之一，然而HCC的发病机制迄今仍未明了。近年来，缝隙连接（gap junction，GJ）结构和功能的研究为探索多种肿瘤和转化细胞的发生机制提供了新思路。GJ是位于两个相邻细胞之间的一种蛋白质连接通道，由特殊的通道蛋白——缝隙连接蛋白（connexin，Cx）组成，主要功能是直接介导相邻细胞之间的信号转导，从而对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起重要的调控作用，该过程称为缝隙连接细胞间通讯（gap junctional intercellular communication，GJIC）。研究表明，GJIC正常功能的维持能抑制多种肿瘤包括HCC的发生［3，4］。正常肝细胞间GJIC功能旺盛，但癌变后显著下调，原因可能为Cx表达减弱、缺失或Cx的细胞质内异位表达［5］。相反，恢复肿瘤细胞间GJIC的功能，在一定程度上能够逆转肿瘤或转化细胞的恶性程度［6］。现今认为Cx基因异常表达所致的GJIC功能缺陷可能是HCC发生的重要机制之一。本文对近年来GJIC与HCC关系的研究进展进行综述，试图从GJ介导的信号通路异常理论，为探讨HCC发生、发展的分子机制及提高疗效提供新思路。

1 GJIC的形成

Cx是多基因家族编码的一类结构相似而分子量不同的蛋白质，目前在人类共发现有21种，分别以其分子量大小命名，如Cx26、Cx32和Cx43等。在细胞膜上，每6个形状相同、功能一致的哑铃形Cx蛋白环绕中央孔道排列聚集形成连接子（connexon），即半通道（hemichannel）。两相邻细胞半通道端对端锚接（docking）形成直径约1.5nm的完整蛋白质通道——GJ。当GJ通道开放时，允许离子（如Na＋、K＋、Ca2＋等）及其他相对分子质量＜1 kDa的小分子物质（如第二信使cAMP、cGMP、IP3等参与细胞生长分化的调节物质）通过。不同物质通过GJ通道在相邻细胞间流动以进行信息和能量的交换现象称为GJIC。GJIC是不耗能的被动扩散过程并参与多种生物学事件的发生，其中重要的生物学功能包括：⑴信号传递功能。细胞通过GJIC交换细胞间的离子信号和其他调节信号。如当细胞受到某种刺激或外界信息时，其离子电位发生变化，该离子或调节信号通过GJ迅速传递至相邻细胞，使之也在短时间内对信号反应，从而完成机体的整体功能。⑵缓冲某些化学物质的毒性作用。当细胞受到某些毒性化学物质损害时，可通过一系列GJ通道向周围细胞排出毒物，稀释该细胞的毒物浓度，减少毒物对细胞的损害。⑶通过周围细胞滋养受损细胞。如上所述，当某个细胞受损害时，GJIC不仅可向周围正常细胞传导损伤带来的效应，也可以经周围细胞向受损细胞提供所需要的营养物质，协助恢复功能。当然如果细胞受损严重或毒物浓度过高，GJ通道关闭，可致该细胞死亡而避免毒物扩散。⑷参与组织的局部代谢。组织GJIC功能良好时，局部组织的代谢物质经GJIC调节作用可得到适当地分配，使代谢物质均匀分布于相邻不同的细胞。此外，通过GJIC的分配作用，一些功能缺陷的细胞也可得到功能恢复和扩增的机会。由此可见，GJIC是细胞生物学行为的重要调控方式，在细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等多种生理过程中发挥重要作用［7］。

2 GJIC功能异常在肿瘤发生、发展中的作用

恶性肿瘤（包括HCC）的发生及转移是一个多步骤、多阶段的复杂过程，首先是机体在一系列致癌因素作用下部分“自由”细胞无控性增殖恶变，然后该恶变细胞从原发瘤脱落并侵入到基质，进入血管或淋巴管，再随血流运行到靶器官的终末性血管并与血管内皮细胞特异性地黏附，最后穿过基膜在靶器官组织克隆性生长。在这个过程中，GJIC功能的异常发挥重要作用。正常水平的GJIC能够增强细胞与细胞之间的结合力，使细胞不易脱落。GJIC对细胞的生长、增殖等生物学行为起调控作用。在肿瘤形成的早期阶段，某些癌基因如neu、ras、c-myc等的异常表达或抑癌基因p53的低表达都可降低GJIC［8］，GJIC功能下降可导致肿瘤细胞之间失去正常的调控信息，同时使密度依赖性生长抑制作用丧失并失去器官整体控制作用。肿瘤细胞的失控性生长引起局部张力增加，容易导致肿瘤细胞的脱落并向张力低的基质间隙侵袭。而肿瘤细胞GJIC功能的下调或缺失，可能造成肿瘤特异性抗原提呈缺损或免疫细胞不能识别肿瘤细胞；也可能由于不能向免疫细胞传递cAMP、蛋白激酶、IP3等信息物质，免疫细胞不被激活，致使肿瘤细胞逃脱免疫系统的监视和杀伤而在循环中生存下来，继而运行到靶器官。最后肿瘤细胞与血管内皮细胞黏附后建立起异源性GJIC。如肿瘤细胞可通过GJIC向血管内皮细胞传送某种信号物质（如花生四烯酸的代谢产物12（s）-HETE），使血管内皮细胞收缩并释放蛋白水解酶，进而引起基质的溶解和破坏，促使肿瘤细胞穿过内皮细胞层及基质，最后进入继发部位克隆性生长。细胞内存在多种信号转导途径和方式，且有交叉调控的特点。细胞间通讯可调节细胞信号转导，信号转导也可反向影响细胞的通讯过程。可见GJIC并非孤立地影响肿瘤发生、发展，而是与其他因素相互协调、影响，共同构成控制肿瘤生长的网络系统。

3 GJIC在正常肝脏组织中的形成及功能

在正常肝脏组织中，主要存在Cx26、Cx32、Cx43基因的表达［9］。其中Cx32均匀分布于肝细胞中，形成肝脏GJ的90%。Cx26次之，主要分布于门静脉周围。Cx43只在肝脏内皮细胞、胆管内皮细胞和库否氏细胞中表达，但不出现在正常的肝细胞中。这些Cxs共同组成肝细胞物质传递和信息通讯功能的结构基础，维持正常肝细胞的GJIC，在协调肝脏组织内环境稳定、细胞分化及生长控制过程中起着重要的作用。研究表明，多种外来的或内源性化学物质可通过不同的机制影响肝细胞Cx的表达及其组成的GJIC水平［10，11］。而肝脏中Cx结构功能的变化，可以改变GJ通道的通透性和对通透物质的选择性，进而影响细胞之间的物质交换和信号传递而导致细胞功能异常。研究表明，GJIC功能异常与肝脏癌变的发生、发展有密切的关系［5］。

4 HCC中GJIC的异常及可能机制

HCC组织中存在两种类型GJ，一种是同型GJ（正常细胞间及肿瘤细胞间的GJ）；另一种是异型GJ（肿瘤细胞与周围正常细胞间的GJ）。恶性程度不同的HCC组织均存在肿瘤细胞间同源性、肿瘤细胞与周围细胞间异源性通讯功能的缺陷，使肿瘤细胞逃避了邻近正常细胞的调控，经过选择性生长最终形成恶性肿瘤，可能是HCC发生的重要机制。GJIC异常主要表现为Cx的异常，其分子机制可能与以下几方面有关：⑴有功能的Cx表达降低。研究表明，在多数肿瘤（包括HCC）的形成过程中，常伴随Cx的表达降低或缺失。恢复肿瘤细胞Cx的表达水平，可抑制肿瘤细胞的生长，诱导其分化，有利于重建正常细胞的生长调控机制。Cx被公认为一种抑癌基因［3，12］。如在HCC发生过程中，Cx32基因敲除的小鼠因为缺乏功能性的GJIC，导致自发性或化学诱导的HCC发生率明显增加［13］；Plante等［14］在六氯苯（hexachlorobena，HCB）致雌鼠癌变动物模型中发现，Cx32和Cx26的mRNA及蛋白表达水平均显著下降，同时其介导的GJIC功能也减弱，进一步研究证实HCB诱导的GJIC下降发生于雌鼠肝癌形成前。提示Cx和GJIC下调形成于化学诱导的肝癌形成的早期阶段。由此Plante等［14］提出将Cx32的表达下降作为肝脏肿瘤的一个早期标志。应用免疫组化进一步研究发现，人HCC组织样本中Cx32mRNA及蛋白的表达水平较癌旁正常肝组织显著减少［15］。而在体外向肝癌细胞转染Cx32上调GJIC则能抑制癌细胞增殖速度和克隆形成［6］。⑵Cx基因突变。研究证实特异Cx的突变与各种遗传性疾病的发生有关［16］，而Cx基因突变与肿瘤是否有关成为近年研究者们研究的热点之一。研究发现，在12只化学诱导致HCC的大鼠中只有1只发生Cx32基因220位密码子的突变［17］，而且这种组氨酸向精氨酸的突变在功能上是沉默的，因为荧光染料示踪实验显示Cx32仍对不同的刺激如cAMP和溶血磷脂酸有正常反应［3］。在人类散在性结肠癌中也发现Cx43基因的特异性突变，可能与肿瘤的进展有关［18］。但目前尚未有关Cx43基因在HCC中突变的报道。Cx基因被认为是一种区别p53基因的非突变型肿瘤抑制基因，亦被称为第二类非突变抑癌基因。（3）异常Cx的表达。研究发现，在正常肝细胞中检测不到的Cx43可出现在肿瘤浸润组织中［19］，提示肝脏组织中Cx的异常锚定并不取决于其表达的Cx类型，而其异常表达与肿瘤形成的阶段有关。Zhang等［20］发现Cx43在HuH7细胞中的表达量是在另一种恶性程度相对较低的HepG2细胞的100倍，Cx43异常上调的同时，Cx32 mRNA和蛋白表达水平下降，猜测可能是由于Cx43通过与Cx32的转录因子如HNF-1（hepatic nuclear factor-1）相互作用而降低了Cx32启动子的活性，进而使Cx32介导的GJIC功能降低，最终导致HuH7细胞失去周围正常细胞的调控而致使恶化不断进展。因此有学者把HCC中Cx43的异常出现视为“去分化过程（dedifferentiation process）”的一个标志。虽然目前对于异常Cx43表达的机制仍未清楚，但该现象的发现为探索HCC进展的分子机制提供新思路。（4）Cx蛋白分布异常。Nakashima等［15］应用免疫组化进行定位及定量研究发现，HCC组织中不仅存在Cx32数量的下降，且所有Cx32表达阳性的细胞均出现分布异常（除少数样本同时可见部分细胞膜表达，大多数Cx32仅异位表达于细胞质中），并且把这一现象归因于Cx的内化作用（internalization）。体外实验发现HuH7肝癌细胞系中高表达的Cx32同样定位于细胞质而不形成功能性的GJIC［21，22］，当把HuH7细胞接种到SCID小鼠体内时，细胞质高表达的Cx32可以促进HuH7细胞的浸润和转移能力［22］。这一发现改变了Cx异常定位仅被视为GJIC下调原因之一的观点。现今认为，虽然Cx32介导的正常GJIC功能能够抑制HCC的发生，但一旦肝细胞发生恶性转化，细胞质内Cx32蛋白的过多蓄积可能增强癌细胞的运动和侵袭能力而与肿瘤转移有关。

目前Cx在细胞质异常定位的分子机制尚不清楚，有学者认为与另一类的连接蛋白如钙黏蛋白（E-cadherin）的作用有关，因为肿瘤细胞中常伴随Cx与E-cadherin的共下调或异常定位［23，24］。E-cadherin作为参与上皮细胞间识别过程中的主要蛋白，它的异常可导致细胞间的识别损伤，使Cx蛋白未能准确定位到细胞膜上。

5 GJIC在HCC防治中的作用

研究证实，Cx基因的表达对绝大多数肿瘤细胞的生长起负调控作用，GJIC功能的恢复表现为肿瘤生长控制和转化表型抑制，因此上调或恢复肿瘤细胞间的GJIC水平可能为肿瘤治疗提供新思路和策略。究其原因，Cx基因不仅本身可抑制肿瘤，还可促进其他肿瘤治疗方法的疗效。如药物等损伤因素在引起细胞死亡的同时，可以诱导细胞产生某种“死亡信号”，这种“死亡信号”通过GJIC传递到毗邻的细胞，引起相邻细胞的死亡从而扩大了药物的细胞毒性，即所谓的“旁观者效应（bystander effect，BE）”。BE不仅可在肿瘤化疗［25，26］过程中观察到，也是肿瘤放疗［27］和基因治疗［28］一个显著的特性。根据BE的发生机制，增强GJIC功能的疗法或药物有望用于肿瘤治疗和逆转耐药，这已被多个研究（包括本课题组）证实［29，30］。此外，提高肿瘤细胞GJIC功能，还可使靠近血管的细胞在获取药物、氧和营养后，由GJ运至远处细胞，从而使药物在肿瘤组织内均匀弥散，增强化疗药物的治疗效果。

如果在早期癌变阶段，恢复肿瘤间和肿瘤与周围正常细胞间的异常GJIC功能，可能可以干预甚至逆转肿瘤的进程。因为化学诱导细胞癌变需要多个相关基因的突变，其中一个可能发生在化学致癌剂对细胞的启动时，而多数是在其后长达数月的时间内完成。在这段时间里，组织内源性的因子诱发了进一步的基因突变。而处于封闭状态的局部组织容易产生这些致突变因子［31］。因此我们推测，当肝细胞接受内源性或外源性致癌因素后，小鼠肝GJIC功能的下降，使已经处于启动的恶性细胞失去周围正常细胞对其调控，恰好形成这种相对封闭的状态。因而，及时上调GJIC水平，解除这种状态可能有助于阻止进一步的基因突变。另一方面，GJIC能力正常或被强化时，正常细胞可向被启动的细胞输入信号物质，使之也正常化，而不致发展成癌细胞［3］。人类肝癌一般潜伏期更长，因此及时上调或恢复GJIC功能可能更有利于阻断肝细胞进一步恶变。目前可通过化学药物（如维甲酸［30，32］、类固醇类［11］、cAMP［32］等）诱导Cx蛋白的表达，或通过基因治疗［33］等手段提高GJIC水平。

综上所述，GJIC的功能异常与HCC的发生、发展关系密切。Cx基因在肝癌细胞中的表达及其调控机制异常引起的GJIC缺陷，导致细胞间通讯功能障碍、细胞内信号转导紊乱，最终导致肝癌细胞的恶性转化。未来通过研究不同来源HCC组织和细胞中GJIC表达模式和规律，对进一步深入了解HCC发生、发展的机制，为其治疗提供新的靶点和治疗策略具有重要意义。同时应积极寻找改善肿瘤细胞GJIC的方法和途径，以进一步提高现有肿瘤治疗的疗效。

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［2014-07-28收稿］［2014-08-29修回］［编辑 罗惠予］

R735.7

A

1674-5671（2014）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.03.20

安徽省自然科学基金资助项目（1408085QH166）；蚌埠医学院科技发展基金资助项目（Bykf13A12）

张凯。E-mail：zk29788@163.com