慢病毒载体的演化、生产及临床应用

唐勇梁霞综述 王琪审校

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院1泌尿外科，2放疗科，3实验研究部

综述

慢病毒载体的演化、生产及临床应用

唐勇1梁霞2△综述 王琪3审校

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院1泌尿外科，2放疗科，3实验研究部

慢病毒载体是在人类免疫缺陷病毒-1基础上改造而成的病毒载体系统，能够稳定、高效地将目的基因转导入人或动物的原代细胞或不分裂细胞中持续表达。经过三代演变，其转染的效率及安全性得到了明显提高。本文对慢病毒载体的演化、生产优化及其在肿瘤基因等治疗中的应用进行综述。

慢病毒载体；演化；生产；临床应用；肿瘤基因治疗

慢病毒（lentivirus）属逆转录病毒之一，包括人艾滋病毒、猴艾滋病毒、羊Visna/Maedi病毒等7个亚属，其中对人艾滋病毒的生活史及基因结构的了解最为清楚。慢病毒在宿主细胞内，能以病毒RNA为模板在自身反转录酶的作用下合成cDNA，再以此cDNA为模板合成双链DNA，经环化后通过病毒整合酶作用整合在宿主细胞的染色体上并长期表达。因此，以慢病毒基因组为基础，除去其复制所需要的基因，代之以治疗基因和选择性标志物构建而成的慢病毒载体（lentiviral vector，LvV），其特点为转移基因片段容量大、不易诱发宿主免疫反应、安全性较好，不仅能感染分裂细胞，还能感染不分裂细胞（如神经细胞、造血干细胞、肌纤维细胞和肝细胞等），并可稳定整合于靶细胞的基因组，治疗基因表达时间长。因此，慢病毒载体已成为当前基因治疗中基因转移载体研究的热点，人们对它寄予了攻克和治愈肿瘤的厚望。本文以人类免疫缺陷病毒-1（human immunodeficiency virus-1，HIV-1）为代表对慢病毒载体的演化、生产优化及其在HIV及肿瘤基因治疗中的应用作一综述。

1 慢病毒载体的演化

慢病毒作为复杂的逆转录病毒家族中的一个成员，目前广泛用于基因载体及临床研究。LvV是在HIV-1基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效地将目的基因转导入人或动物的原代细胞系或非分裂细胞中稳定、持续表达。LvV自1996年在体内用于转导如神经元等不可再生细胞后得到快速发展。

过去几十年中，LvV已连续更新了三代，取得了很大的发展。LvV每次更新都使载体的生物安全性得到提高。在第一代LvV系统，包装质粒编码了除被膜基因外的其它所有HIV基因。不同病毒来源的异质性被膜基因能够从体外二次包装质粒表达而获得。在第二代载体系统中，出于生物安全性考虑，去除了8种HIV-1基因中的4种基因（vif、vpr、vpu和nef），只有tat、rev、gag和pol 4种基因得到保存并可进行转录。tat和rev基因的主要功能是通过转录和反转录机制参与病毒转录的调节，而gag和pol基因分别编码慢病毒的结构和酶成分。对这些基因的筛选去除了HIV病毒主要的毒性，很大程度上提高了载体的安全性。LvV更大的进步是删除了一部分3′端长末端重复序列（long terminal repeat，LTR），此部分3′LTR能使转染载体的5′LTR端的载体基因发生转录，但整合的载体序列会使转染载体失去它的LTR启动子。这些自我灭活的载体需要自身的启动子来激活基因表达，但在转染细胞中它能去除载体全部转录时所生成产物导致的危险。第二代LvV包装系统的这些特点，使其具有安全、高效及易操作性，并广泛用于实验研究。第三代LvV系统通过去除tat基因，保留gag、pol和rev基因，从而增加了质粒的安全性，并逐步用于临床。tat基因的丢失也需要含有不依赖tat基因启动的劳斯肉瘤病毒（rous sarcoma virus，RSV）启动子的载体5′LTR端的替换。尽管第三代LvV系统的安全性已经大大提高，但第二代LvV系统因其P2条件下的高安全性仍然广泛应用于实验室。

2 慢病毒载体的生产

2.1 目前慢病毒载体生产存在的问题

一般来说，标准的LvV产生需要依赖辅助质粒（包括辅助质粒、糖蛋白编码的信使质粒及LvV质粒）对人胚胎来源的肾细胞（human embryonic kidney，HEK 293T）进行瞬时转染，转染HEK 293T细胞后产生的慢病毒微粒释放到HEK 293T细胞的培养上清液中。尽管近几年，有新的LvV生产方法及一些使用特殊转染试剂的转染方法，如Lipofectamine 2000［1］、LipofectamineTM、SuperFect［2］、FuGENE和GeneJammer transfection reagent［3］等已经成功用于LvV的生产，但由于高成本限制了其广泛使用。因此，使用磷酸钙沉淀瞬时转染方法仍是LvV最常用的生产方法。这种方法最主要的缺点是需要大量的DNA和依赖最合适pH值的HEPES缓冲液，而HEPES缓冲液的pH值会随着时间的推移发生改变，从而导致转染效率差异较大，LvV的滴度亦有较大的不同［4］。与此同时，尽管LvV包装系统的安全性及发展都已取得很大的进步，但未成熟的LvV的滴度平均只有106～108TU/ml［5］，这在体内是远远不够的，还需要更多的介质、细胞数和质粒DNA来生成未成熟的慢病毒。而相对较低的慢病毒转染效率是目前LvV发展中一个较大的瓶颈。因此，生产高滴度、高质量的LvV仍然是耗时、耗资的，而LvV包装系统的技术要应用于未来，则需要改进LvV的生产方法以获得高滴度的载体。

2.2 慢病毒常用的生产方法

通常LvV的生产有两种方法：一种是依赖有着稳定载体包装系统的细胞系；另一种是瞬时转染方法。尽管目前已有几种稳定载体包装系统的细胞系被培养出来［6］，但因某些原因限制了这些细胞系的应用。首先，需要较长周期才能培养出稳定载体包装系统的细胞系［7］；其次，转基因或载体成分可能含有毒性而不适合用于含有稳定载体包装系统的细胞系［8］；第三，每构建一种新的载体都需要一种新的载体包装系统细胞系；第四，稳定的载体包装系统的细胞系通常产生的病毒滴度较低，且缺乏能够用于长期培养的稳定性，从而使长期培养存在一定问题［5］。而质粒的瞬时转染能使慢病毒的生产变为简单和节约时间，从而避免了含有稳定载体包装系统的细胞系长周期的培养［9］。另外，在瞬时转染载体体系中，许多转基因和信使糖蛋白能够很容易被置换掉［10］，因此通过瞬时转染生产LvV的方法仍然最常用。

2.2.1 聚乙稀亚胺介导的慢病毒生产 近年来，由聚乙稀亚胺（polyethylenimine，PEI）介导的瞬时转染方法也用于LvV生产［11］，并作为一种转染成分用于重组病毒载体（如腺病毒载体或LvV）［12，13］。由PEI介导的瞬时转染方法用于LvV生产有几个优点：首先，PEI价格相对便宜，能使其更广泛用于实验室；其次，PEI较稳定，不需要依赖pH值，从而能保证确切的、较高的转染率［14］；第三，PEI已被证明在黏附和悬浮的细胞中都能被有效转导［15］。

基于PEI介导的瞬时转染方法，最适宜的条件包括介质的选择、收获的时期、细胞的密度、质粒DNA的数量以及滴度的测定方法都能被优化以达到最佳的优化。转染过程中对这些条件的优化能使LvV的滴度增加约100倍。使用这些优化方法，使LvV的滴度和使用CaPO4介导的瞬时转染产生的载体滴度是一样的。相比CaPO4介导的瞬时转染，PEI介导的瞬时转染更易在培养液中获得，而且转染不需要依赖pH值，转染细胞亦不需要在转染后频繁地更换培养液。同时，要得到相同数量LvV所需要的DNA数量比CaPO4介导的瞬时转染方法少10倍，且可重复性和一致性更好。因此，使用PEI介导的瞬时转染能使转染过程变得简单，显著减少了质粒DNA的数量和缩短了LvV的生产时间。

在慢病毒生产过程中，PEI介导的瞬时转染过程的条件优化需要考虑以下因素。比如PEI中的氮和DNA中磷的比例（N/P）［16］、DNA的数量［17］等。此外，每个培养板PEI的量可能会动态改变［7］，DNA混合物与转染细胞的比例也是非常重要的考量因素［18］。同时，转染过程中培养液是否含有血清亦是需要考虑的优化条件之一。虽然，LvV产生过程中由PEI介导的瞬时转染可在含血清的培养液中进行，但亦有在不含血清的培养液中进行瞬时转染的报道［18］。在瞬时转染后，LvV的收获时间可在48～72 h内进行，目前研究发现LvV在转染后48 h可开始被收获［13，17，19］。在PEI介导瞬时转染过程中，不同的细胞密度产生的病毒滴度也不同，不同的载体需要的细胞密度也不同。根据Kuroda等［17］研究结果，当HEK 293T细胞的密度为每15 cm的培养板上（1～2）×107TU/ml时，LvV的滴度相对受影响较少，这些数据表明在LvV产生过程中细胞的密度也是影响因素之一。在培养液中增加蛋白能提高转染效率［20］，但这些添加物对于LvV的产生是否有好处，尚需进一步实验证实。不同的LvV包装细胞用于生产慢病毒的效率并不相同，尽管HEK 293T细胞已被广泛用于LvV的产生，但HeLa细胞和XDC293细胞亦可用作重组病毒产生过程中载体包装细胞系［12］。

在应用PEI介导的瞬时转染方法时，药物毒性亦是需要考虑的因素［18］。PEI的分子量决定了其有效性和毒性。分子量小的PEI无毒性，但有效性低。Toledo等［19］研究发现当使用25kDa大小的PEI时能产生大约1×107TU/ml浓度的LvV。另有研究发现交联的PEI能增加基因切割的效率［16］。

在病毒滴度检测优化方面，将eGFP基因转染给小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast cell，NIH 3T3）能获得LvV滴度。Barde等［21］研究发现检测最佳转染滴度的方法是用能编码GFP的质粒进行转染。包含转基因mRNA水平测定在内的不同LvV滴定法都和慢病毒生产的效率有关，可以用来测定非荧光转基因的滴度［22］。与此类似的是，荧光标记的LvV的浓度则能通过实时荧光定量PCR测定。当LvV仅能感染小鼠的细胞时，可利用NIH3T3细胞来测定LvV滴度。而当LvV表达水疱性口炎病毒G蛋白时，它也能感染人的细胞，因此HeLa细胞也可用于测定LvV滴度［21］。

除了提高转染效率外，我们也能通过对细胞培养上清液进行处理来纯化或增加病毒的浓度，从而提高LvV的滴度。其中包括用不含血清的培养液及物理浓缩法，该法包括超速离心［10］、HYPERFlask vessels［23］或过滤、透析过滤［13］。

2.2.2 PEI与 CaPO4介导的慢病毒生产的比较 在CaPO4介导的瞬时转染所需的最适宜条件中，pH值是最为重要的参数。事实上，CaPO4介导的瞬时转染的效价也受信使质粒的结构影响。从水疱性口炎病毒G糖蛋白的信使蛋白获得的效价比从狂犬病G糖蛋白的信使蛋白获得的效价高10倍以上［24］。CaPO4介导的瞬时转染的效价同样和CaPO4的浓度、复合物形成时间及细胞周期有关［25］。

PEI介导的瞬时转染和CaPO4介导产生的LvV滴度是一样的。Toledo等［19］研究也发现尽管使用PEI能产生更高的载体滴度，但PEI介导的瞬时转染的效价并不比CaPO4介导的好。但在利用HEK 293T细胞和HeLa细胞产生腺病毒时，相比CaPO4，线性PEI是一种更好的转染试剂［12］。通常，由瞬时转染产生的LvV滴度是106～107TU/ml［17，18］。LvV滴度降低，其中可能的主要原因是出于安全性考虑使用了亲水性信使蛋白对LvV进行重构。已有研究证明这种信使蛋白产生的载体滴度比水疱性口炎病毒G糖蛋白产生的载体滴度低［17，20］。尽管还有很多因素能提高载体滴度，但PEI是目前最为有效的方法。

3 慢病毒载体的临床应用

目前，LvV作为一种重要的工具应用于转基因及基因干扰治疗中。LvV能转染静止期细胞、分裂周期长的细胞及不分裂的细胞（如造血干细胞、神经元和神经胶质细胞等），也能整合到宿主细胞基因，使其能长时间地表达转基因和有较强的包装能力。这些均使LvV能较好地用于基因治疗。整合到宿主中的慢病毒不会引起炎症反应或免疫反应，从而能在宿主中、不同组织中长期表达转基因。此外，正常的肿瘤逆转录病毒载体在胚胎时期不表达，这限制了其在小鼠转基因学发展中的应用。而LvV在胚胎时期可以表达，因此能在体外被重建而用于转基因动物的研究［25］。近几年，已经开展LvV用于治疗HIV感染患者的Ⅰ期临床试验［23］。

2009年Cartier等［26］利用LvV编码野生型ABCD1基因治疗2例肾上腺脑白质营养不良患者，治疗24个月及30个月后患者检查结果提示治疗成功且无明显毒副反应。Chen等［27］的研究证实相对于腺病毒，VSV-G慢病毒系统由于其转染的高效性，使其更适合于肺癌的转基因治疗。Gambari等［28］利用LvV将β-球蛋白基因转导至人的造血干细胞中治疗β-地中海贫血，使1例19岁的β-地中海贫血患者在接受基因治疗后，无须定期输血4年后仍健康生存。利用LvV携带络氨酸羟化酶、三磷酸鸟苷环化水解酶、芳香L-氨基酸脱羧酶作用于脑纹状体治疗帕金森氏病的Ⅰ期、Ⅱ期临床试验均取得了较好的效果［29］。

将肿瘤相关抗原转染树突状细胞（dendritic cell，DC）引起对肿瘤的特异性免疫应答是肿瘤免疫治疗的方法之一，而肿瘤相关抗原转染DC细胞以LvV为首选。Dullaers等［30］研究发现慢病毒转染OVA基因骨髓来源的DC细胞介导强烈的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxiclymphocyte，CTL）抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤形成，制约肿瘤向外生长，相同的方法将三种肝癌相关抗原进行转染，激活CD4+和CD8+T细胞对三种抗原作出免疫应答，导致肿瘤缩小，三种抗原在肝癌中异常丰富表达，为未经修饰的自身抗原，作者推测三种抗原的共同表达打破了抗原丢失引起的肿瘤逃逸现象。

4 展望

目前主要用于肿瘤基因治疗载体有病毒学载体和非病毒学载体。非病毒学的基因转移方法效率较低，在用于人体试验的肿瘤基因治疗方案中绝大多数是以病毒学方法进行基因转移。而LvV与其他逆转录病毒载体相比，具有许多优点，携带的外源基因在宿主中表达时间长、毒性低、可携带的外源基因片段大、不易诱发宿主免疫反应，在靶细胞的免疫治疗中具有较好的应用前景。LvV介导的免疫治疗，不但可以用于治疗肿瘤，还可以用于治疗感染性疾病、自身免疫性疾病及器官移植排斥反应。然而，在慢病毒应用于临床治疗之前，有许多问题尚待解决，如生物安全、生物干扰和靶向性问题等。近年来，生物安全和生物干扰问题取得了较大进展，LvV基因重组、繁殖衰减和自身失活避免了慢病毒的体内重组，位点专一的整合和非整合的慢病毒消除了潜在的病毒介导的基因突变。目前，最大的困难是病毒感染的靶向性问题，需要我们进一步研究新的LvV系统及改进其生产、浓缩流程，才能使其更有效地应用于临床研究。

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［2014-07-19收稿］［2014-08-28修回］［编辑 游雪梅］

Q782

A

1674-5671（2014）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.03.19

国家自然科学基金资助项目（81360341）；广西自然科学基金资助项目（2011GXNSFC018020,2012GXNSFAA053163）；广西医疗卫生适宜技术研究与开发课题（S201301-06）

王琪。E-mail：qi_catcat@163.com

△梁霞为共同第一作者。