内皮祖细胞在缺血性卒中后血管再生中的作用

谢宸宸，罗勇

卒中是威胁人类健康的三大疾病之一。每年全球约有550万人死于卒中[1]。每年因卒中死亡人数占全部死亡人数的9.7%，发展中国家卒中患病人数占全球患病人数的85%[2]。专家预测，如无有效的临床和公共卫生干预，2030年初患卒中的人数将升至2300万，卒中死亡人数将升至780万。其中，缺血性卒中占卒中的88%[3]。缺血性卒中后血管再生、脑循环结构与功能的重建是脑神经网络结构和功能重建的重要基础、前提及保障[4]。缺血性卒中后的血管重建通过内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）增殖、迁移、分化形成新生血管，有效地促进脑缺血组织的血管再生[5]。研究提示，EPC可促进缺血组织的血管再生和修复，促进缺血性卒中患者的神经功能恢复，同时也可独立预测心脑血管疾病患病风险[6]。含EPC的人自体细胞治疗可用于治疗心脑血管疾病及其他周围血管缺血性疾病[7]。目前EPC在缺血性卒中后血管再生中的作用受到广泛重视。现就近期EPC及其在缺血性卒中后脑内血管再生中的作用做一综述。

1 EPC的生物学特点

EPC分为造血系统来源EPC和非造血系统来源EPC，其中造血系统来源EPC包括形成集落的EPC、不形成集落的EPC、骨髓源性EPC等，主要存在于骨髓。

EPC表面标记有：CD34、VEGFR2、CD133、c-Kit、Sca-1、CD45、CD14、CD11、vWF等。在成血管祖细胞衍变为成熟内皮细胞（endothelial cell，EC）的过程中，EPC可能呈现多种细胞表面标记，故通过细胞表面标记鉴定EPC亦具挑战性。以往，多认为CD34+/VEGFR2+/CD133+细胞即为EPC，但近来发现其更可能是造血干细胞而非EPC，认为其并不能分化为EC[8]。Yang等[9]发现，与Lin－、c-Kit+、Sca-1+，Lin－、c-Kit+，Lin－、Sca-1+联合标记相比，仅CD34+标记的EPC具有更强的归巢及成血管能力，认为CD34可能更适合用以分选功能性EPC。CD34－细胞促血管再生能力的丧失，再次突显了CD34+细胞的促血管再生作用[10]。Madeddu等[11]认为CD34+VEGFR2+细胞可能占EPC的大部分比例，认为更多抗原标记结合虽可能更特异地鉴定EPC，却会造成更低的检出率。因此，如何选择简单而特异的抗原标记鉴定EPC是未来研究的目标之一。

至今仍无特异鉴定EPC的方法，目前主要采用的方法有：细胞培养及细胞集落形成试验；EPC表面抗原标记分选EPC亚型。根据体外培养EPC时程长短，可分为4种类型：①早期EPC：主要表达CD45、CD14、CD11等早期表面标志[12]；②内皮细胞集落形成单位（colonyforming units-EC，CFU-EC）：其归类为EPC目前颇有争议，有研究认为将其命名为循环内皮细胞更为合适，因其在体内可能通过不分化为EC的方式促进血管再生[13]；③晚期EPC：由早期EPC进一步长时培养而得，更富成熟EC特性[10]；④EC克隆形成细胞（endothelial colony-forming cells，ECFC）：可不表达骨髓系和造血系表面标志，具有强大的EC分化潜能。ECFC的来源仍不清楚，有研究者认为其可能来源于血管壁，若此假设成立，ECFC可能就不是真正的干细胞，而是具强增殖能力的EC[14]。目前大多认为短时程培养的EPC（如早期EPC、CFU-EC）主要通过分泌促血管再生因子以促进血管的形成，而长时程培养的EPC（如晚期EPC、ECFC）则主要通过分化为EC而促进血管再生[15]。目前虽说把EPC分为早期和晚期EPC受到了大多学者的认可，但由单核细胞培养所得细胞仍比较混杂，这种分类方法是否正确还有待考证。

2 EPC与缺血性卒中

2.1 外周血EPC水平与缺血性卒中后功能恢复及预后的关系 缺血性卒中后外周血EPC水平与脑梗死面积及预后明显相关。Taguchi等[16-17]采用流式细胞术检测缺血性卒中已发作3年及以上患者的外周血EPC数量，并通过颅脑磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）计算梗死面积、脑氧代谢率和正电子发射断层扫描评估患者的脑血管功能情况，对患者行1年的随访后，再次检测外周血EPC数量，美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）评价患者神经功能恢复情况。结果发现CD34+EPC数量与梗死面积、脑血管功能密切相关，且CD34+细胞水平可预测神经功能的恢复情况。Ghani等[6]采用流式细胞术检测病程＜4 h的急性缺血性卒中患者的外周血CD31+vWF+EPC数量，收集患者的患病年龄，吸烟、高血压、糖尿病、高脂血症等心脑血管疾病危险因素，并进行Framingham风险评分，结果发现CD31+vWF+EPC数量与患病年龄、心脑血管疾病危险因素及Framingham风险评分显著相关。Brea等[18]采用蛋白质组学方法，分析急性缺血性卒中患者及正常人的外周血EPC的蛋白表达，发现两者EPC的蛋白表达种类及量不同，考虑这种差异可能与缺血性卒中应激对EPC功能的调控相关。EPC不仅可预测缺血性卒中的预后及神经功能情况，同时其对缺血性卒中的发作亦有一定保护作用。如李龙宣等[19]通过检测既往有同侧短暂性脑缺血发作（transient ischemic attack，TIA）史的缺血性卒中发作24 h内的患者外周血CD34+KDR+EPC数量，NIHSS评价其入院时的神经功能，颅脑计算机断层扫描（computed tomography，CT）测量脑梗死体积，发现前期TIA发作可促进循环EPC的动员，而早期外周血EPC数量可决定急性脑梗死的严重程度，故推测前期TIA发作对EPC的动员作用引起的循环EPC数量增加可能改善急性脑梗死的严重程度，指出前期TIA发作引发的EPC数量增加对后继缺血性卒中发作具有一定保护作用。总之，外周血EPC数量与脑缺血发作及其预后明显相关，其可用于评估具有血管危险因素患者的脑缺血发作可能及其预后。如何上调外周血EPC水平以增加脑内血管再生及改善缺血性卒中预后是治疗研究的重要靶点。

2.2 EPC移植在缺血性卒中后血管再生中的作用 缺血性卒中后EPC可通过增殖、迁移、归巢至脑缺血区域参与脑内血管再生。Moubarik等[20]将脐带血中分离培养的ECFC通过股静脉移植至大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠体内并通过放射性标记追踪，发现移植24 h后ECFC即可定植到脑缺血区，增加碱性磷酸酶标记的微血管密度，并改善神经功能缺损程度评分（modified Neurological Severity Score，mNSS）。Hess等[21]静脉移植绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的骨髓源性细胞至MCAO大鼠眼眶后窦，发现缺血后3～7 d即可见GFP标记的骨髓源性细胞参与缺血区域的血管再生。EPC移植促进血管再生的同时也促进神经修复。富奇志等[22]将大鼠分为假手术组、缺血对照组、缺血后神经干细胞（neuron stem cell，NSC）移植组（NSC组）、缺血后EPC移植组及NSC+EPC移植组，移植区域为大脑缺血半暗带区，结果发现各时间点NSC+EPC组血管新生数量明显多于NSC组、EPC组和缺血对照组，EPC可以促进移植入MCAO模型大鼠缺血半暗带的NSC增殖，减少其凋亡，2种细胞共移植可以促进缺血半暗带的血管新生。EPC移植虽可强有力地促进缺血性卒中后的血管再生，但外源性的EPC的运用目前仍存在多种未解决的问题，如移植途径、时间、数量、细胞来源及其安全性均有待进一步研究。

2.3 EPC及SDF-1α/CXCR4轴在缺血性卒中后血管再生中的作用 缺血性卒中后脑缺血区可释放缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor，HIF-1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基质蛋白衍生因子-1α（stromal derived factor-1α，SDF-1α）、红细胞生成素等，激活并动员骨髓EPC入血。其中，SDF-1α/CXCR4轴在缺血性卒中后EPC的动员、迁移、归巢中的作用受到广泛关注。研究发现MCAO大鼠侧脑室内予以SDF-1α，可增加脑缺血区血流量，诱导骨髓源性细胞至脑缺血区，减少梗死体积[23]。SDF-1α与其受体CXCR4结合可通过激活多种信号转导通路而介导其生物学行为。CD34+CD133+KDR+EPC可表达大量CXCR4受体，而SDF-1α能增强其迁移、黏附能力。过表达CXCR4的EPC尾静脉移植可减少脑缺血糖尿病模型小鼠的脑梗死体积，上调脑缺血区的微血管密度[24]。Paczkowska等[25]发现缺血性卒中患者1 d、3 d和7 d的外周血中CD133、CD34和CXCR4表达的增加均伴随有血浆SDF-1α表达的增加，且急性缺血性卒中患者的SDF-1α水平与早期外周血EPC数量相关[19]。孙宏毅等[26]采用祖国传统医学电针干预大鼠“合谷穴”，发现MCAO后大鼠外周血SDF-1α的表达上调，骨髓和外周血VEGFR2+EPC、CXCR4+EPC数量增加，而电针可进一步增加外周血EPC数量及SDF-1α的表达。同时，外周血SDF-1α浓度可作为循环EPC数量的预测指标。Xiao等[27]对Bruneck研究群体的SDF-1α、CXCR4的单核苷酸基因多态性、外周血血浆SDF-1α和EPC数量等进行研究，发现SDF-1α基因多态性能够影响血浆SDF-1α浓度、循环EPC数量。综上所述，SDF-1α可能增强脑缺血后EPC的动员、迁移和归巢至缺血区域，且这一过程与SDF-1α/CXCR4轴密切相关。

EPC不仅可用于评估和预测心血管疾病，亦可用于评估具有血管危险因素患者缺血性卒中发作的可能并评估其预后。EPC动员、迁移、归巢参与脑缺血区血管再生机制很多，希望可以探索出简单有效并可广泛应用于临床的干预手段，以达到改善缺血性卒中患者的治疗效果并促进患者康复的目的。近年来对缺血性卒中后EPC在血管再生中作用的研究多采取了细胞移植的手段，而整体水平的研究较少，对于机体内源性EPC在脑缺血损伤后重要的促血管再生作用研究较少，且外源性EPC的运用目前仍存在多种未解决的问题：如如何通过血脑屏障；如何选择更为有效的EPC植入途径；如何克服外源性EPC移植后的衰老、死亡，如何增强其存活能力；EPC最佳移植数量及最佳移植时间；如何保持外源性EPC的遗传稳定；如为异体移植，如何克服其免疫排斥反应等等。因此，应进一步增加关于内源性EPC在缺血性卒中后脑内血管再生中作用的研究。目前尚无特异的EPC鉴定方法，因此在一定程度上限制了内源性EPC的鉴定及其相关的研究。如何选择简单且更为特异的抗原标记鉴定EPC是未来研究的目标之一。EPC主要存在于骨髓，缺血性卒中应激对机体自身骨髓EPC的调动能力有限，故有效调动并促进EPC归巢参与血管再生的干预手段十分必要。总之，EPC的功能及鉴定的不确定性在一定程度上限制着EPC从缺血性卒中的基础研究向临床实践应用的延伸。为精确鉴定EPC，了解其根本生物学特性，理清其促进缺血性卒中后血管再生的作用机制，探索动员内源性EPC的有效干预手段，并应用于临床诊疗，还需做进一步深入的探索。

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【点睛】

内皮祖细胞可通过增殖、动员、迁移、分化为内皮细胞，从而参与缺血性卒中后的脑内血管再生。