运动系统中干细胞衰老及其机制研究进展

贾治伟 李 威 王德利 何阮狄克

. 综述 Review .

运动系统中干细胞衰老及其机制研究进展

干细胞 ( stem cell ) 是一种具有自我更新和多向分化潜能的未成熟细胞。根据干细胞来源不同，通常分为 3 类：胚胎干细胞 ( embryonic stem cell )、成体干细胞 ( adult stem cell ) 及多能诱导干细胞 ( induced pluripotent stem cell )[1]。几乎在所有成体组织和器官中均发现干细胞的存在。这些干细胞在参与组织修复与再生，维持内稳态平衡中发挥至关重要的作用[2]。随着干细胞移植治疗研究的进展，干细胞衰老 ( stem cell aging ) 现象逐渐引起广泛重视[2-3]。这一发现彻底颠覆了人们对干细胞的传统认识。既往被认为“无限活力”和“无所不能”的干细胞，同成熟细胞一样也面临着衰老问题，从而限制了干细胞移植治疗的应用。目前认为干细胞衰老是机体衰老的主要原因，是疾病发生和发展的重要机制，也是干细胞治疗领域迫切需要面对的问题[4]。本研究仅就运动系统中干细胞衰老现象及其相关机制做如下综述。

对干细胞和衰老的认识

一、干细胞的定义

虽然目前对干细胞研究较为广泛和深入，但是对于干细胞的定义仍比较模糊，甚至存在争议[5-6]。干细胞虽然在形态结构或分子水平上有一定的特殊性，但因其功能强大，通常从功能方面来定义干细胞。干细胞是指处在细胞谱系最顶端的具有全能性和自我更新能力的细胞，并且在体内能够扩增形成特定组织的细胞。为了与有限自我更新能力的祖细胞 ( progenitor cells ) 相区别，尤其将干细胞定义为终生具有自我更新能力[6]。由于干细胞通常处在不同功能功能状态，是具有明显异质性的细胞群[7-8]，加之干细胞和祖细胞本质很难区别[5]，故我们统一采用干细胞来描述。

二、衰老的定义

如果说干细胞定义存在争议，那么定义衰老则更加困难。通常认为衰老是指多细胞有机体的再生机制的总体受限[3]，体现为所有组织器官稳态和再生能力的下降[9]。这一定义强调了干细胞对组织和器官细胞再补充的作用。与衰老概念易混淆的老化 ( senescence ) 是指体细胞复制一定次数后生长缓慢、活力减低失去分裂增殖能力，功能减退。与细胞凋亡不同，老化细胞仍然存活，但停滞在 G1期，不能顺利进入 S 期，可合成分泌基质，但表现出表型改变和基因表达模式的改变[10]。目前多数学者使用衰老来描述干细胞，而使用老化来描述成熟细胞。

运动系统中干细胞衰老的证据

干细胞衰老因其来源组织不同、获取个体不同以及干细胞衰老程度不同，表现并不尽相同。然而，目前认为衰老的干细胞具有三个方面特征性表现：数量、质量 ( 分化 / 再生能力 ) 以及迁移能力的改变[3]。来自衰老机体的干细胞通常数量减少；衰老的干细胞形态学出现体积变大、细胞扁平、细胞核变大；增殖能力则表现为传代次数减少，传代时间间隔延长，集落形成减少；多向分化潜能仍然存在，但向特定组织分化能力 ( 如成软骨分化、成骨分化、成脂分化等 ) 存在差异性变化；迁移能力出现迁移速度变慢，定向迁移性减弱，迁移运动方式改变等[3,9,11]。

一、骨髓间充质干细胞衰老

骨髓间充质干细胞因其具有取材方便、易于体外培养、低免疫原性和高增殖潜能，成为早期开展干细胞治疗和组织工程修复的种子细胞，其良好的应用前景得到广泛认可。近年来，由于老年患者干细胞治疗效果不佳以及体外扩增后出现干细胞功能下降等现象，骨髓间充质干细胞的衰老引起广泛重视，成为限制其临床应用效果的重要因素[3,12]。

Asumda 等[13]发现年轻鼠的骨髓间充质干细胞表达干性基因 Oct-4、Sox-2 和 Nanog，而老年鼠没有检测到Sox-2 和 Nanog 基因的表达。此外，老年鼠获得的骨髓间充质干细胞成骨、成软骨及成脂分化能力明显下降，并且向成心肌诱导分化未能成功，而年轻鼠则可行。Han 等[14]研究发现衰老的骨髓间充质干细胞成肌分化能力下降，而通过使用与干细胞全能性相关的转录因子 Nanog 能够逆转。Yu 等[15]在恒河猴的骨髓间充质干细胞研究中发现，随着年龄的增加，干细胞增殖能力和分化能力下降，并伴有日周期蛋白及 MicroRNA 的差异性表达。Zaim 等[12]从不同年龄阶段志愿者获取骨髓间充质干细胞进行长期体外培养研究，发现来自年老志愿者的骨髓间充质干细胞较早出现细胞体积变大、扁平，并且细胞增殖率、成脂分化、成骨分化及成神经分化能力随年龄增加均下降，而成软骨分化能力无明显变化。Brohlin 等[16]将骨髓间充质干细胞向神经胶质细胞诱导分化，发现来自老年志愿者的干细胞诱导后表达神经胶质细胞表型明显低于年轻者。进一步将骨髓间充质干细胞与鼠背根神经节共培养，发现老年组干细胞促进轴突生长的能力明显低于年轻组。

二、骨骼肌干细胞衰老

骨骼肌干细胞，又称卫星细胞 ( satellite cell )，首先由 Mauro 报道[17]。这是一种位于肌膜和基底膜之间的梭形单核干细胞。通常处于静止状态。当肌肉受到损伤或刺激时，骨骼肌干细胞就会被激活并增殖出新的干细胞，同时与原有骨骼肌细胞相互融合，形成新的肌纤维细胞[18]。

随着机体衰老的进展，骨骼肌出现进行性萎缩并出现功能下降。早期研究认为衰老个体肌肉中骨骼肌干细胞数量减少是出现这一现象主要原因，而 Hikida 等[19]认为随着年龄增加骨骼肌干细胞数量的减少并不明显，即使数量减少也不会是肌肉再生受限的原因，因为骨骼肌干细胞通常是处于静默状态，只有激活后才会增殖及肌肉再生，只要肌肉干细胞功能得以维持，就可以更新出新的肌肉干细胞并引起肌肉再生。由此认为骨骼肌干细胞衰老才是直接原因[19-20]。Collins-Hooper 等[11]研究发现来自老年鼠的骨骼肌干细胞的增殖率及形成的细胞簇明显低于年轻组，并且进入分化阶段延迟。在人肌腱干细胞的体外研究中，Corbu 等[21]还发现来自年老患者的肌腱干细胞增殖能力及生肌分化能力明显下降。此外，干细胞向受损区域迁移能力是修复组织损伤的重要功能。Collins-Hooper 等[11]发现衰老的骨骼肌干细胞的迁移能力明显受损，迁移速度不足年轻者一半。衰老干细胞迁移呈现过度膨胀的趋势，出现异常的细胞膜伸缩特征，并低表达参与细胞黏附和迁移的整合素。一氧化氮作为细胞迁移的重要信号分子，可以恢复衰老的骨骼肌干细胞的迁移能力；而肝细胞因子作为一氧化氮介导的信号传导的下游因子，能够恢复衰老细胞的迁移速度缺陷，却不能纠正迁移的方向性。

三、肌腱干细胞衰老

肌腱损伤是骨科临床常见疾病，由于肌腱组织自身再生能力差，再生的肌腱主要由瘢痕组织构成，结构和强度很难满足患者生理活动的需求。Bi 等[22]首先从人和鼠的肌腱组织中成果分离和提取出肌腱干细胞，并开始将肌腱干细胞用于修复肌腱损伤的研究。

Zhou 等[23]发现鼠肌腱干细胞随着年龄的增加，干性基因表达无明显差异，而分离获取的干细胞明显数量减少，干细胞自更新能力及损伤修复能力下降，并出现分化能力改变，同时表达肌腱系细胞的特征性基因减少，而向脂肪分化基因增加。这有助于阐释年老患者肌腱中脂肪组织比例高的现象。Ruzzini 等[24]从不同年龄阶段患者绳肌腱中分离肌腱干细胞，发现干细胞衰老影响了获取肌腱干细胞的数量和自我更新能力，而多向分化潜能仍然存在。来自年轻患者的肌腱干细胞高表达成骨和成脂基因，而老年患者则高表达成软骨基因。将有助于解释衰老及跟腱病中出现的成软骨性退变。Kohler 等[25]研究发现来自老年患者的肌腱干细胞体外扩增能力明显下降，克隆形成单位也明显减少，还伴有衰老相关的细胞周期抑制基因p16INK4a表达增加。此外，基因芯片分析发现衰老肌腱干细胞调节细胞黏附、迁移和细胞骨架肌动蛋白明显出现差异性表达。进一步行时移分析显示衰老肌腱干细胞迁移速度和距离明显下降，并随着肌动蛋白应力纤维变粗、含量升高而更新减慢以及 ROCK 激酶产物和活性增加，而使用ROCK 激酶抑制剂能够抑制这些现象，由此提示细胞与细胞外基质相互作用失调以及 ROCK 激酶通路可能是肌腱干细胞衰老的重要机制。

四、软骨干细胞衰老

软骨因其具有无血管、无神经的特点，被认为是缺少自我修复能力的组织。近年来，在关节软骨、纤维软骨 ( 椎间盘组织 ) 及弹性软骨组织 ( 耳软骨组织 ) 中均发现软骨干细胞的存在[26]。最近，Chang 等[27]研究发现软骨干细胞也存在衰老现象。从胎儿、健康成人和老年人股骨髁关节软骨中获取的软骨干细胞，发现胎儿组细胞增殖率和成软骨分化能力明显高于其它组。成骨分化能力并没有随年龄增加而下降，然而在老年组干细胞发现自发成骨分化现象。以上现象提示衰老的软骨干细胞发生低软骨分化和自发成骨分化改变，可能与原发性骨性关节炎的发展有关。

运动系统中干细胞衰老的机制

一、端粒及端粒酶

端粒长度对细胞分裂次数和细胞寿命具有决定性作用，而端粒长度维持主要依赖于端粒酶活性[9,28]。来自衰老个体干细胞的端粒存在明显缩短现象，并与体外增殖能力的下降相一致[28]。端粒长度缩短可降低干细胞的增殖、分化及迁移能力，而增强端粒酶活性则具有提高作用[9,19]。将人端粒酶逆转录酶转入干细胞，显著延长干细胞寿命，增殖能力也明显活跃，并且可以更好地维持干细胞的多向分化能力[28]。

二、信号通路

多种内在因素和外在因素均可导致干细胞衰老。内在因素，如干细胞的自我复制、端粒酶活性下降等，可引起端粒进行性缩短。当端粒缩短到一定程度，端粒功能就会出现障碍，进而产生类似于 DNA 损伤的信号来诱导细胞衰老。这种衰老现象与细胞复制增殖明显相关，被称为“复制性衰老”[9-10]。研究表明 p19Arf/ p53 / p21Cip1/Wafl信号通路是介导“复制性衰老”中端粒缩短的主要机制[3,9,29]。外在因素，如微环境、炎症因子等，即使端粒没有缩短至产生损伤信号的程度，细胞也会在短时间内发生衰老。这种非端粒缩短信号介导的衰老，被称为“早熟性衰老”[9-10]。目前认为 p16INK4a/Rb信号通路是介导“早熟性衰老”中应激信号传导的主要机制[3,9,29]。此外，Wnt 信号通路在干细胞衰老过程中也发挥重要作用[9]。Brack 等[30]发现骨骼肌衰老伴随着肌肉组织纤维变性的发生，其原因是衰老的骨骼肌干细胞易于从生肌性细胞向生纤维性细胞转化，而 Wnt 信号通路是介导骨骼肌干细胞的主要信号通路。项晓霞等[31]在骨髓间充质干细胞衰老的研究中，发现老年鼠血清培养骨髓间充质干细胞可以激活Wnt 信号通路，这一通路对骨髓间充质干细胞衰老发挥重要调控作用。

三、MicroRNA

MicroRNA ( miRNA ) 作为另一种重要的干细胞衰老调控机制，近年来也引起了国内外学者的高度重视。Kim等[32]研究发现 miR-27b 和 miR-371 调控骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，而 miR-204 和 miR-211 则参与骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

运动系统中干细胞的发现是近年来骨科相关干细胞研究的重大突破。然而，干细胞衰老为干细胞移植治疗的基础及临床研究提出了新的课题，同时为骨与肌肉组织疾病的病因学机制研究提供了新的思路。目前，运动系统中干细胞衰老研究仍处在起步阶段，存在许多问题需要解决：( 1 ) 运动系统中干细胞是胚胎期存留下的，还是经血液系统动员来的骨髓源性干细胞；( 2 ) 干细胞衰老是组织/器官衰老或疾病产生的原因，还是结果；( 3 ) 干细胞衰老研究多来源于体外研究，而其体内机制是否相同；( 4 ) 干细胞衰老是干细胞群的表现，其中未衰老干细胞的分离手段及其未衰老的原因尚待进一步研究。相信随着干细胞衰老研究的深入，将拓展对骨科相关疾病发生和进展的认识，有助于优化分离和获取高活性干细胞的手段，甚至可以干预或延缓干细胞衰老，为干细胞治疗开拓更广阔的的应用前景。

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( 本文编辑：王永刚 )

Research progress on stem cell aging and its mechanism in locomotor system

JIA Zhi-wei, LI Wei, WANG De-li,HE Qing, RUAN Di-ke. Department of Orthopedics, Navy General Hospital, Beijing, 100048, PRC

Stem cells are of self-renewing ability and multi-differentiating potential, with a broad prospect in clinical application. It has been proved that stem cells can be found in almost all adult tissues and organs. A new direction has been inspired in basic and clinical studies of the treatment of musculoskeletal diseases after the discovery of stem cells in locomotor system. However, as the research on stem cell transplantation continues, stem cell aging has been gradually recognized and gaining extensive attention. It is thought that stem cell aging is an important reason for organism aging and diseases, and also a new challenge to stem cell treatment. Recently, the aging of bone-marrow mesenchymal stem cells, skeletal muscle stem cells, tendon stem cells and articular cartilage stem cells have been proved. The manifestations of stem cell aging in locomotor system mainly include the alternations of quality, quantity and migration ability. Stem cell aging is conducted through the telomere and telomerase, p19Arf/ p53 / p21Cip1/Waflpathway, p16INK4a/Rbpathway, Wnt pathway and MicroRNA. The studies on stem cell aging in locomotor system is at the beginning stage and there are still many issues needed to be solved. The research progress on stem cell aging and its mechanism in locomotor system are reviewed in this paper.

Sports medicine; Stem cells; Stem cell research; Cell aging

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.10.011

Q254

100048 北京，海军总医院

阮狄克，Email: ruandikengh@163.com

2013-11-13 )