短瓣金莲花不同提取部位的抗氧化活性

樊肇胜，程 佳，王利军，李丹丹，秦 莉，张艳玲，董阿力德尔图，朝格图

短瓣金莲花不同提取部位的抗氧化活性

樊肇胜，程 佳，王利军，李丹丹，秦 莉，张艳玲*，董阿力德尔图，朝格图

（内蒙古大学化学化工学院，内蒙古 呼和浩特 010021）

目的：研究短瓣金莲花的抗氧化活性部位。方法：将短瓣金莲花药材依次用石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、60%乙醇、30%乙醇和去离子水提取，采用紫外-可见分光光度法对不同溶剂提取部位的黄色素、总黄酮和总酚含量进行分析，并测试各提取部位对羟自由基（·OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除作用以对其抗氧化活性进行研究。结果：短瓣金莲花石油醚提取部位的黄色素含量最高，为（11.37±0.07 ）mg/g；而60%乙醇提取部位总黄酮和总酚含量最高，分别为（213.21±1.12）mg/g和（121.75±0.58） mg/g，95%乙醇提取部位次之，分别为（200.47±0.65）mg/g和（105.19±0.61）mg/g。石油醚提取部位清除·OH能力最强，半抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC50）为92.77 mg/L；95%乙醇提取部位清除DPPH自由基能力最强，IC50为10.14 mg/L，60%乙醇提取部位次之，IC50为10.70 mg/L。结论：短瓣金莲花清除·OH能力与黄色素含量呈正相关性，而清除DPPH自由基能力与黄酮和多酚含量呈正相关性；短瓣金莲花的石油醚和95%乙醇提取部位是最佳的抗氧化活性部位，有待进一步深入研究。

短瓣金莲花；抗氧化活性部位；黄色素；总黄酮；总酚；羟自由基；DPPH自由基

短瓣金莲花（Trollius ledebouri Reichb.）为毛茛科金莲花属多年生草本植物，在我国主要分布于黑龙江及内蒙古东北部等地区，其花为蒙药金莲花（阿拉藤花-其其格）的药用品种之一，具有清热解毒、消肿、明目等功效，主治感冒发热、咽喉肿痛、急性鼓膜炎和急性淋巴管炎，在民间亦作保健茶饮用[1-4]。研究发现，短瓣金莲花与金莲花类似，主要含有黄酮类、黄色素、生物碱、挥发油、鞣质及有机酸等化学成分，具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎、镇痛等活性[5-14]。现代药理研究表明黄酮类化合物为金莲花属植物主要有效成分，生药鉴别和药品质量评价也均以黄酮类成分荭草苷、牡荆苷等为指标[6]。李楠[15]、赵二劳[16]、侯滨滨[17]等发现金莲花中黄酮类化合物对食用油脂具有较强的抗氧化作用，且不会造成健康损害，具有良好的开发前景。此外，金莲花中含有大量黄色素，其主要成分为叶黄素-环氧化合物及金莲花黄质，属于类胡萝卜素类成分，具有良好的抗氧化活性，但其研究较少[18-19]。本实验系统研究了短瓣金莲花不同溶剂提取部位黄色素、总黄酮和总酚含量及其清除羟自由基（·OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力，为其临床药用和天然抗氧化剂的进一步开发提供实验依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金莲花药材购自亳州市京皖中药饮片厂（产地：东北），经鉴定为毛莨科植物短瓣金莲花的干燥花。

石油醚（沸点60～90 ℃）、乙酸乙酯、95%乙醇、硫酸亚铁、磷酸二氢钠、磷酸二氢钠、双氧水（均为分析纯） 天津市北联精细化学品开发有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；DPPH（纯度≥96%）、焦性没食子酸（分析纯）、邻二氮菲 阿拉丁试剂有限公司；芦丁标准品（色谱纯≥98%） 北京世纪奥科生物技术有限公司；抗坏血酸 天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

U-3900H紫外-可见分光光度计 日本日立公司；RE-52旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ循环水式真空泵 巩义予华仪器公司；DZF-6090真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；MILLI-Q DIRECT 8超纯水器 美国Millipore公司；VFD-1000冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司；FA1004分析天平 上海精天电子仪器有限公司；pH计 奥豪斯仪器上海有限公司；DF-101XP集热式水浴锅 江苏正基仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 短瓣金莲花的提取

将干燥短瓣金莲花称取适量，粉碎，依次分别用石油醚（沸点60～90 ℃）、乙酸乙酯、95%乙醇、60%乙醇、30%乙醇和去离子水加热回流提取，各3 次，将各提取液过滤、减压浓缩并冷冻干燥后得到各提取部位。

1.3.2 黄色素含量的测定

黄色素的含量以叶黄素计。叶黄素在波长（446±1）nm处有最大吸收，可根据该波长处测定吸光度和标准百分吸光系数E1%1cm计算其含量。试样中黄色素含量X以质量分数（%）表示[20]，其计算见公式（1）。

式中：A为短瓣金莲花各提取部位吸光度；N为稀释倍数；m为短瓣金莲花各提取部位质量/g；2 550为叶黄素百分吸光系数（E1%1cm）。

以适当乙醇-水溶液配制短瓣金莲花石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、60%乙醇、30%乙醇和去离子水提取部位的测试溶液。用紫外-可见分光光度计测定，以无水乙醇为空白对照，在447 nm波长处测定短瓣金莲花各提取部位的吸光度，将检测得到的吸光度代入公式（1），得到短瓣金莲花不同提取部位的黄色素含量。

1.3.3 总黄酮含量的测定

[15-16,21]，以芦丁作对照品，测定短瓣金莲花不同提取部位的总黄酮含量。准确吸取60%的乙醇配制质量浓度为0.6 mg/mL的芦丁标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL试管内，相应加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL的60%乙醇溶液；再加入0.5 mL 5%亚硝酸钠溶液摇匀，放置6 min；加入0.5 mL 10%硝酸铝溶液，放置6 min；加入4.0 mL 4%氢氧化钠溶液，最后加60%乙醇溶液定容到10 mL，摇匀后，放置15 min；在505 nm波长处测定吸光度。用0.0 mL芦丁标准溶液作为空白，以芦丁质量浓度（9.15×10-3、18.30×10-3、27.45×10-3、36.60×10-3、45.75×10-3mg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为：y= 56.225x+0.221 5（R2=0.998 8）。短瓣金莲花不同提取部位分别配制成溶液后同法测定，将吸光度代入上述标准曲线方程得到短瓣金莲花不同提取物中总黄酮的含量。实验重复3 次。

1.3.4 总酚含量的测定

参考文献[22-23]，以焦性没食子酸作对照品，采用Folin-Ciocalteu法测定短瓣金莲花不同提取部位的总酚含量。精确吸取质量浓度为0.020 mg/mL的焦性没食子酸溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL，分别置于10 mL比色管中，均加入5 mL去离子水、0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，1 min后加入1.5 mL质量浓度为75.0 mg/mL的Na2CO3溶液，去离子水定容至刻度，摇匀，75 ℃水浴反应10 min。在最大吸收波长767 nm处测定吸光度。用0.00 mL焦性没食子酸溶液作为空白，以焦性没食子酸质量浓度（5×10-4、10×10-4、15×10-4、20×10-4、25×10-4mg/mL）作为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为：y=37.933x-0.317 5（R2=0.996 9）。短瓣金莲花不同提取部位分别配制成溶液后同法测定，将吸光度代入上述标准曲线方程得到短瓣金莲花不同提取物中总酚的含量。实验重复3 次。

1.3.5 对·OH清除作用的测定

利用邻二氮菲法，精确移取0.5 mL 0.75 mmol/L的邻二氮菲溶液、1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）和0.5 mL双蒸水，摇匀，再加入0.5 mL 0.75 mmol/L的硫酸亚铁溶液，摇匀，最后再加入0.5 mL 0.01%过氧化氢溶液，37 ℃恒温水浴60 min，在509.5 nm波长处测定其吸光度，记作A损；另一比色管中用0.5 mL双蒸水代替0.5 mL过氧化氢，测定其吸光度，记作A未；再在一比色管中用不同质量浓度梯度的VC对照溶液或短瓣金莲花不同溶剂提取部位样品溶液代替0.5 mL双蒸水，在509.5 nm波长处测其吸光度，记作A样。平行测定3 次，记录吸光度，按式（2）计算不同质量浓度VC对照溶液或短瓣金莲花不同溶剂提取部位样品溶液对·OH的清除率（S/%），并计算出半抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC50）。

1.3.6 对DPPH自由基清除作用的测定

参考文献[24-25]的方法，将短瓣金莲花不同溶剂提取部位用60%乙醇配成1 g/L的溶液，VC用去离子水配成0.1 g/L的溶液，用时稀释至质量浓度1、2、3、4、5 mg/L。DPPH用60%乙醇配成65 μmol/L的溶液，依注解加样于具塞比色管中，摇匀反应30 min后，用紫外-可见分光光度计于520 nm（DPPH最大吸收波长）处测定吸光度（60%乙醇溶液为参比）。取3 次实验的平均值按式（3）计算其清除率并得出IC50。

式中：S为DPPH自由基清除率/%；A0为1.5 mL 65 μmol/L DPPH溶液加入1.5 mL 60%乙醇溶液的吸光度；Ai为1.5 mL 65 μmol/L DPPH溶液加入1.5 mL样品溶液的吸光度；Aj为1.5 mL 60%乙醇溶液加入1.5 mL样品溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 短瓣金莲花不同提取部位的提取率

表1 短瓣金莲花不同溶剂提取部位的提取率Table 1 Extraction rates from the flowers Trollius ledebouri by different solvents

由表1可知，短瓣金莲花95%乙醇、石油醚和60%乙醇提取部位的样品量较多，分别占到总提取率的29.67%、25.03%、20.18%。

2.2 短瓣金莲花不同提取部位的黄色素含量

图1 短瓣金莲花不同提取部位的黄色素含量与对·OH的清除作用Fig.1 Yellow pigment content and hydroxyl radical scavenging effects of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri

由图1可知，短瓣金莲花石油醚提取部位中黄色素含量最多，为（11.37±0.07）mg/g，其次为乙酸乙酯提取部位和去离子水提取部位，分别为（2.77±0.16）mg/g和（2.10±0.14）mg/g，95%、60%和30%乙醇提取部位中黄色素含量相当，分别为（1.17±0.07）、（1.27±0.07）、（1.17±0.07）mg/g。

2.3 短瓣金莲花不同提取部位的总黄酮含量

图2 短瓣金莲花不同提取部位的总黄酮和总酚含量与对DPPH自由基的清除作用Fig.2 Contents of total flavonoids and total phenols, and DPPH radical scavenging effects of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri

由图2可知，短瓣金莲花60%乙醇溶剂提取部位中的总黄酮含量最高，为（213.21±1.12）mg/g；95%乙醇提取部位次之，为（200.47±0.65）mg/g；石油醚提取部位含量最低，为（17.60±0.39）mg/g。

2.4 短瓣金莲花不同提取部位的总酚含量

由图2可知，短瓣金莲花60%乙醇溶剂提取部位中的总酚含量最高，为（121.75±0.58）mg/g；95%乙醇提取部位次之，为（105.19±0.61）mg/g；石油醚和去离子水提取部位总酚含量最低，分别为（14.79±0.22）mg/g和（15.41±0.05）mg/g。

2.5 短瓣金莲花不同提取部位对·OH的清除作用

表2 短瓣金莲花不同提取部位和VC对OH的清除作用Table 2 Hydroxyl radical scavenging effects of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri

由表2可知，测得短瓣金莲花不同提取部位对·OH的清除能力由大到小依次为：VC＞石油醚提取部位＞乙酸乙酯提取部位＞95%乙醇提取部位＞60%乙醇提取部位＞去离子水提取部位＞30%乙醇提取部位，其中，石油醚、乙酸乙酯和95%乙醇提取部位的清除能力较强，IC50分别为92.77、106.54、110.90 mg/L。进一步比较短瓣金莲花不同提取部位的黄色素含量与对·OH的清除能力（图1）发现，黄色素含量与对·OH的清除能力呈现一定的正相关性。

2.6 短瓣金莲花不同提取部位对DPPH自由基的清除作用

表3 短瓣金莲花不同提取部位和VC对DPPH自由基的清除作用Table 3 DPPH radical scavenging effects of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri

由表3可知，短瓣金莲花不同溶剂提取部位对DPPH自由基的清除能力依次为：VC＞95%乙醇提取部位＞60%乙醇提取部位＞乙酸乙酯提取部位＞30%乙醇提取部位＞去离子水提取物部位＞石油醚提取部位，其中，95%提取部位清除DPPH自由基的能力是最强的，IC50值为10.14 mg/L，60%乙醇提取部位次之，IC50值为10.70 mg/L，与对照VC（IC50=2.44 mg/L）较为接近。进一步比较短瓣金莲花不同提取部位的总黄酮和总酚含量与对DPPH自由基的清除能力（图2）发现，总黄酮和总酚含量与对DPPH自由基的清除能力呈现一定的正相关性。

3 结 论

本实验发现，短瓣金莲花石油醚提取部位提取率较高、黄色素含量最高、总黄酮和总酚含量最低、清除·OH能力最强；95%和60%乙醇提取部位提取率亦较高、黄色素含量最低、总黄酮和总酚含量最高、清除DPPH自由基的能力最强；而乙酸乙酯部位提取率最低、黄色素、总黄酮和总多酚含量均较低、清除·OH和DPPH自由基的能力较弱。短瓣金莲花清除·OH的能力与黄色素含量呈正相关性，而清除DPPH自由基的能力与总黄酮和总酚含量呈正相关性。不同部位清除不同类型自由基的能力不同。

综合分析短瓣金莲花对·OH和DPPH自由基的能力，可知其石油醚、乙酸乙酯、95%和60%乙醇提取部位均具有一定的抗氧化活性。而进一步结合各部位提取率的情况，可知石油醚和95%乙醇提取部位是短瓣金莲花的最佳抗氧化活性部位。短瓣金莲花含有黄酮类、黄色素、生物碱、挥发油、鞣质及有机酸等化学成分，其抗氧化活性是其中所含有多种成分综合作用的结果。这两个活性部位除含黄色素和黄酮类成分外，可能还含有其他具有抗氧化活性的化学成分，具体还含有哪些抗氧化活性成分、其抗氧化能力以及作用机理有何区别、各个成分之间有无协同作用，有待进一步深入研究。

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Antioxidant Activity of Different Solvents Extracts from Flowers of Trollius ledebouri Reichb

FAN Zhao-sheng, CHENG Jia, WANG Li-jun, LI Dan-dan, QIN Li, ZHANG Yan-ling*, DONG Alideertu, Tsogt
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China)

Purpose: To explore the antioxidant activity of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri Reichb. Methods: The dried flowers were extracted sequentially with petroleum ether, ethyl acetate, 95% ethanol, 60% ethanol, 30% ethanol and deionized water. Each extract obtained was analyzed by ultraviolet-visible spectrophotometry for the contents of yellow pigment, total flavonoids and total polyphenols, and their radical scavenging activity against hydroxyl and DPPH free radicals were tested. Results: Petroleum ether extract had the highest content of yellow pigment (11.37 ± 0.07) mg/g; 60% ethanol extract from the flowers of Trollius ledebouri had the highest content of total flavonoids (213.21 ± 1.12) mg/g and total polyphenols (121.75 ± 0.58) mg/g, 95% ethanol extract had slightly lower contents of total flavonoids (200.47 ± 6.49) mg/g and total polyphenols (105.19 ± 0.61) mg/g. Petroleum ether extract had the strongest hydroxyl radical scavenging ability with IC50of 92.77 mg/L, while 95% ethanol extract had the strongest DPPH radical scavenging ability with IC50of 10.14 mg/L and 60% ethanol extract had slightly lower DPPH radical scavenging ability with IC50of 10.70 mg/L. Conclusion: The hydroxyl radical scavenging capacity presented a positive correlation with the concentration of yellow pigment, and the DPPH radical scavenging capacity presented a positive correlation with the concentration of total flavonoids and total polyphenols; petroleum ether and 95% ethanol extracts from the flowers of Trollius ledebouri have potent antioxidant activity.

flowers of Trollius ledebouri; antioxidant extracts; yellow pigment; total flavonoids; total polyphenols; hydroxyl radical; DPPH radical

R932；Q949.95

A

1002-6630（2014）17-0012-05

10.7506/spkx1002-6630-201417003

2013-10-19

国家自然科学基金地区科学基金项目（31160332）；内蒙古自治区高等学校科学技术研究项目（NJZZ13015）；内蒙古大学高层次人才引进科研启动项目（Z20100108）

樊肇胜（1993—），男，本科，主要从事天然产物研究。E-mail：fanzhaoshengfzs@163.com

*通信作者：张艳玲（1979—），女，讲师，博士，主要从事天然产物研究。E-mail：zhylthu@126.com