石斛多糖对人Burkitt淋巴瘤Raji细胞增殖、凋亡的影响及机制

任志国

(山东医学高等专科学校附属医院，山东临沂276004)

铁皮石斛是兰科石斛兰属多年生草本植物［1］。《神农本草经》记载其有主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸瘦、强阴、久服厚肠胃的功效［2，3］。多项研究已证实，铁皮石斛中的石斛多糖具有明显抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力、促消化、抗疲劳和抑菌等［4］作用。B细胞性非霍奇金淋巴瘤占全部淋巴瘤病例的68%［1］。近年来，多种治疗方法和药物，如化疗、自体造血干细胞移植、放疗、干扰素等，被用于治疗B细胞性非霍奇金淋巴瘤［2］，但肿瘤缓解率及患者生存率都不理想。2013年6～12月，我们观察了石斛多糖对人Burkitt淋巴瘤Raji细胞增殖的影响，并探讨其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 铁皮石斛由连城铁皮石斛生物制药组培基地惠赠，人Burkitt淋巴瘤Raji细胞株购自中科院上海细胞库，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自上海七海生物科技有限公司;RNA提取试剂盒购自北京TIANGEN公司;MTT购自Sigma公司，RPMI1640、胎牛血清等购自Gbico公司。引物由上海赛百盛生物公司合成。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 石斛多糖的提取与制备 铁皮石斛充分干燥后打成细粉，称取200 g铁皮石斛细粉，60℃石油醚回流脱脂，取残渣挥干溶剂后，80%乙醇回流后挥干溶剂。布氏漏斗抽滤提取液和洗涤液得到浓缩液，Sevag法脱蛋白［5］。取上层液体，以1:4比例加入乙醇沉淀后，抽滤干燥，即得石斛多糖。硫酸蒽酮比色法测定糖含量为82.34%。称取石斛多糖，溶于生理盐水配成适当浓度，过滤除菌备用。

1.2.2 细胞培养及分组 10%胎牛血清1640培养液(含1%青链霉素)，37℃，5%CO2培养人Burkitt淋巴瘤Raji细胞株，每2～3天传代1次。取对数生长期细胞接种于 96孔板(90 μL/孔，1×105个/mL)。设对照组和A、B、C、D组共5组，每组设8个复孔及调零孔。培养12 h后分别加入0、100、200、400、800 mg/L 的石斛多糖溶液，10 μL/孔。

1.2.3 Raji细胞增殖抑制率的测算 采用 MTT法。各组Raji细胞培养24、48、72 h后各观察细胞形态1次，培养72 h后加入 MTT(5 mg/mL，20 μL/孔)，4 h后每孔加入酸化的 SDS溶液100 μL，12 h后测定 OD490。用下列公式计算 A、B、C、D组 Raji细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(对照组OD490－实验组OD490)/对照组OD490×100%。

1.2.4 Raji细胞凋亡率的检测 采用流式细胞术。各组Raji细胞培养48 h和72 h后1 200转/min离心5 min 收集细胞，Binding Buffer(400 μL/孔)重悬细胞，加入 Annexin V-FITC(5 μL/孔)，避光 15 min后加入10 μL PI染液0℃作用5 min，30 min内测量对照组及A、B、C、D组Raji细胞凋亡率。

1.2.5 Raji细胞中Caspase-3 mRNA的检测 采用RT-PCR法。各组 Raji细胞培养48 h后提取总RNA，逆转录获得cDNA。设计引物:Caspase-3(365 bp)上 游:5'-TGACCGAGGCTACATTCAGATGA-CACC-3';下 游:5'-CAAGAGAGTTGGGCTGACCAGAAACAC-3'。β-actin(243 bp):上游:5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3'， 下 游:5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'。50 μL 反应 体 系，扩增条件:94℃ 10 min，30个循环(94℃ 50 s，53℃45 s，72 ℃ 1 min)，72℃ 8 min。扩增产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳后，通过凝胶成像系统计算相对表达量(与β-actin光密度值比值)。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计数资料以±s表示。组间比较采用独立样本t检验或单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 石斛多糖对Raji细胞增殖的影响 各组Raji细胞增殖抑制率见表1。由表1可见，随着石斛多糖浓度的提高和作用时间延长，各组Raji细胞增殖抑制率也升高，P均＜0.05。

表1 各组Raji细胞生长抑制率比较(±s)

表1 各组Raji细胞生长抑制率比较(±s)

组别 n Raji细胞增殖抑制率(%)A组8培养24 h 9.81 ±1.67培养48 h 49.52 ±7.37培养72 h 58.80 ±2.71 B组 8培养24 h 12.78 ±3.32培养48 h 63.43 ±3.29培养72 h 72.51 ±1.64 C组 8培养24 h 14.96 ±1.28培养48 h 73.34 ±1.36培养72 h 79.86 ±5.63 D组 8培养24 h 21.11 ±5.66培养48 h 79.51 ±3.56培养72 h 90.60 ±7.10

2.2 各组Raji细胞凋亡率 各组Raji细胞凋亡率见表2。由表2可见，随着石斛多糖浓度的提高和作用时间延长，各组Raji细胞凋亡率也升高，P均＜0.05。

2.3 Raji细胞中Caspase-3 mRNA表达情况 石斛多糖作用Raji细胞48 h后各组细胞Caspase-3相对表达量分别为对照组0.498±0.054、A 组0.717 ±0.074、B 组 0.837 ±0.048、C 组0.985 ±0.087、D 组1.121±0.058。随着石斛多糖浓度增加，Caspase-3 mRNA表达量逐渐增高，P均＜0.05。

3 讨论

多糖是一类分子结构复杂的糖类大分子物质，是生命物质的重要组成成分之一，并且广泛的参与各种生命活动［6］。研究表明，多糖类物质在提高机体免疫力、抗病毒、抗肿瘤、降低血糖血脂和抗衰老等方面具有重要作用，且越来越多的生物活性多糖已被提取且用于临床［7］。邓鹏等［8］报道多糖具有人鼻咽癌细胞和诱导凋亡的作用。金乐红等［9］在研究中发现，石斛多糖可以有效抑制小鼠肉瘤和离体肝肿瘤细胞的生长。在血液系统肿瘤治疗方面，郑斯卓等［10］指出石斛多糖可通过抑制BCR-ABL融合基因的表达，诱导K562细胞的凋亡。但石斛多糖对人Burkitt淋巴瘤Raji细胞的作用及其机制的研究尚未见报道。

表2 各组Raji细胞后细胞凋亡率比较 (±s)

表2 各组Raji细胞后细胞凋亡率比较 (±s)

组别 n Raji细胞凋亡抑制率(%)对照组8培养48 h 14.12 ±0.57培养72 h 13.97 ±0.37 A组 8培养48 h 15.87 ±0.74培养72 h 19.78 ±0.47 B组 8培养48 h 27.45 ±1.12培养72 h 48.50 ±1.04 C组 8培养48 h 37.87 ±1.45培养72 h 54.75 ±1.54 D组 8培养48 h 43.57 ±1.47培养72 h 53.87 ±0.97

本研究通过水提醇沉淀法从铁皮石斛中提取石斛多糖，体外培养人Burkitt淋巴瘤Raji细胞，将不同浓度石斛多糖作用于 Raji细胞24、48、72 h，MTT法检测石斛多糖对Raji细胞增殖的影响，在100、200、400、800mg/L浓度时石斛多糖对Raji细胞均具有抑制作用，随着石斛多糖浓度的提高，细胞生长抑制率也升高(P＜0.05)。同时对石斛多糖浓度为100、200、400、800mg/L 时，3 个时间段的细胞生长抑制率进行单因素方差分析，结果显示石斛多糖可以抑制Raji细胞增殖并诱导其凋亡，且效果随着作用剂量和时间的增加而增强。

Caspase家族在介导细胞凋亡过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3参与细胞生理及病理性死亡过程，被认为是凋亡的执行者［11］，其表达下调可导致肿瘤细胞凋亡受阻［12］。已有文献报道许多抗肿瘤药物诱导淋巴瘤细胞凋亡的机制可能与Caspase-3的表达有关［13］。本研究采用RT-PCR检测各组细胞Caspase-3 mRNA的表达量，结果显示随着石斛多糖浓度升高，Caspase-3 mRNA表达量逐渐升高，表明石斛多糖可促进Caspase-3蛋白的表达，从而使Raji细胞发生凋亡，是其诱导细胞凋亡的可能机制之一。

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