三裂叶豚草花粉致敏蛋白组分的分离、纯化及鉴定

刘　玲，肖小军，李　兵，何韶衡，刘志刚，杨平常#

(1辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州 121000；2深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所，广东深圳 518060)

三裂叶豚草(Ambrosia trifida Linn.)是豚草花粉中变应性较强的一种，原产于北美洲，在我国辽宁有大面积生长。其花粉颗粒小，粒径18～20 μm[1]，易进入上呼吸道。豚草花粉可溶性蛋白与人体接触后可迅速释放，致变态反应，是秋季花粉症的主要变应原[2]。

目前，国内外对豚草花粉致敏蛋白组分的相关研究报道结果不尽相同，因此，不同地区应根据本地区变应原特点制备出相应制剂，以便对本地区变态反应性疾病进行诊断和治疗[3]。本研究通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)、离子交换层析和蛋白印迹(Western-blotting)等方法对锦州地区豚草花粉致敏蛋白组分进行分离、鉴定，为本地区花粉过敏的诊断及治疗提供资料。

材料和方法

材料来源

三裂叶豚草花粉采自锦州市郊区，特异患者血清由辽宁医学院附属第一医院提供，所有患者豚草皮肤点刺试验(skin prick test，SPT)阳性，且与Western-blotting法检测血清中特异性IgE(specific IgE，sIgE)抗体水平结果相符。

主要仪器与试剂

垂直电泳槽、转膜电泳槽(Model1000/500)、离子交换层析柱；丙烯酰胺(BBI)；十二烷基硫酸钠(SDS)(BIO-RAD)、过硫酸铵(AP)、生物素标记鼠抗人IgE、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(Kirkegaard & Perry Laboratories)、硝酸纤维膜(NC膜)(Gelman laboratory)等。

豚草花粉粗提液提取

取2.0 g豚草花粉于液氮中磨成粉末，按1∶3加入丙酮震荡混匀，沉淀悬浮4℃，1 h。去丙酮，沉淀干燥成粉后称重，按1∶20比例加入Coca’s液(氯化钠5 g，碳酸氢钠2.75 g，结晶酚4 g加蒸馏水至1 000 mL，pH 8.2)，4℃搅拌提取72 h，4℃ 4 000 r/min离心15 min，收集上清，4℃下对蒸馏水透析，冷冻干燥浓缩[4]。

豚草花粉粗提液致敏蛋白组分分离

采用SDS-PAGE体系对豚草花粉粗提液致敏蛋白组分进行分离鉴定。分离胶12%和浓缩胶5%对花粉粗提液中的蛋白组分进行电泳分离，电泳凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液染色，脱色后用凝胶成像及分析系统拍照并分析其相对分子质量。

豚草花粉粗提液免疫学特性鉴定

取10份对豚草花粉存在变态反应患者的血清混合，采用蛋白印迹法对花粉致敏蛋白组分行免疫学特性鉴定。步骤如下：电泳完取出SDS-PAGE凝胶，通过转移槽于冰上将蛋白转移至硝酸纤维膜上；TBS洗涤纤维膜2次，每次5 min；将膜于3%BSA-TBS 4℃封闭过夜；TBST洗膜3次，每次5 min；加入用1%BSA-TBST按5∶1稀释的患者阳性血清37℃孵育2 h，洗膜3次；加入1%BSA-TBST按2000∶1稀释的二抗，室温孵育2 h，洗膜3次；加入1%BSA-TBST按5000∶1稀释的HRP，室温孵育1.5 h，洗膜5次，DAB(3，3′-二氨基联苯胺)显色，摄像后分析其相对分子质量。

豚草花粉粗提液的离子交换柱层析与检测

在FPLC层析控制系统下，用0.02 mol/L(pH 7.2)的Tris-HCl缓冲液充分平衡DEAE-Cellulose DE-52离子交换层析柱，再用此缓冲液透析24 h后的花粉粗提液经0.45 μm滤膜过滤上样，待穿透峰后的基线走平后，改用洗脱缓冲液(0.5 mol/L氯化钠，0.02 mol/L Tris-HCl)进行线性离子梯度洗脱，收集各峰液。透析除盐后冷冻干燥样品。通过SDS-PAGE、Western-blotting分析样品，确定各峰收集液中蛋白的免疫活性部分。

结　　果

豚草花粉粗提液SDS-PAGE

三裂叶豚草花粉主要有30余条蛋白区带，其中主带14条，相对分子质量分别为10 000、13 000、15 000、18 000、20 000、27 000、35 000、36 500、38 000、42 000、56 000、63 000、70 000、100 000；25 000～100 000和10 000～17 000的区带蛋白含量最丰富(图1)。

豚草花粉粗提液免疫学特性鉴定结果

三裂叶豚草花粉提取液中可与变应性患者血清IgE结合反应阳性的蛋白质相对分子质量分别为63 000、56 000、40 000和36 500，其中63 000、40 000和36 500为主要致敏蛋白组分(图2)。

豚草花粉致敏蛋白组分纯化

豚草花粉致敏蛋白组分离子交换层析：对DE-52离子交换层析缓冲液充分透析的三裂叶豚草花粉粗提液上柱，结果显示花粉主要有6个蛋白峰(图3)。

SDS-PAGE和Western blotting检测：离子交换后各峰收集样品进行SDS-PAGE(图4)。离子交换层析后蛋白主要分布在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ峰中，其中Ⅲ、Ⅳ峰蛋白条带相同。Western blotting示主要致敏蛋白组分在第Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ峰(图5)。

讨　　论

花粉过敏又称枯草热，是由气传致敏花粉诱导的变态反应性疾病。一般认为，花粉症发病机制为机体接触花粉变应原后产生IgE抗体，抗体与花粉变应原再次结合于肥大细胞和嗜酸性细胞表面，从而诱发肥大细胞脱颗粒及组胺等炎性介质释放，导致哮喘、鼻炎和结膜炎等疾病。

豚草现已成为一种全国性公害植物，在探讨引起儿童哮喘与吸入性变应原的关系中发现，我国山东省753例儿童哮喘病中由豚草花粉引起的占18.28%[5]；而在抗原皮肤变态反应试验检查中发现，辽宁省沈阳市因豚草花粉传播每年有上万人患病[6]。我国辽宁及其他北方省市地区气传致敏花粉以三裂叶豚草为主，其在花期能产生大量致敏性极强的花粉，从而导致易感人群出现变态反应[7]。豚草花粉最主要的致敏成分是蛋白质，其中包含主要变应原、次要变应原及其他多种杂蛋白成分。因此分离纯化花粉主要致敏蛋白组分，确定其变应原性极其重要。国内外学者对豚草花粉致敏蛋白组分已进行了一系列研究，Lowenstein等[8]证实，短小豚草花粉的粗提液中含大约50种抗原和蛋白质，其中约22种为变应原。在22种变应原中AaBA(36.5 kDa)和Ra 6(8 kDa)具有较强免疫原性[9-10]。国内吴晓曼和黄妩娇[11]通过SDS-PAGE分离得到5种豚草花粉的抗原，相对分子质量分别是18 000、27 000、38 000、42 000和63 000，再结合Western blotting实验，观察到豚草花粉和艾蒿花粉变应原之间存在交叉反应。外国学者在豚草花粉与食物的交叉变态反应研究中发现，其与瓜类和香蕉间存在变应原交叉反应[12]。

本研究通过对三裂叶豚草花粉粗提液的制备，采用SDS-PAGE和Western blotting对该花粉粗提液中蛋白质组分进行分离和免疫学特性鉴定，再通过离子交换层析对主要变应原进行纯化。研究结果发现，锦州地区豚草花粉主要致敏蛋白组分相对分子质量为63 000、40 000和36 500。离子交换层析分离得到6个峰，其中主要致敏蛋白组分主要分布在第Ⅳ、Ⅲ和Ⅰ峰中。与国内研究报道相比较，本实验研究结果未发现相对分子质量约为18 000与27 000的变应原蛋白，其他蛋白基本吻合；但与国外研究结果略有不同。这一结果可能表明豚草花粉可能存在地域差异。本研究为豚草花粉致敏蛋白组分标准化的制定提供了一些实验数据，也为临床豚草花粉变态反应疾病的诊断和治疗奠定了基础。

(本文图1～5见插页Ⅱ)

[1]Solomon WR. Airborne pollen：a brief life[J].J Allergy Clin Immunol， 2002，109：895-900.

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[5]王清菊， 孙爱荣. 752例儿童哮喘及吸入性变应原的关系[J].实用医技杂志， 2003， 10：538-539．

[6]赵玉霞， 王伟， 于润江. 沈阳地区2283人变态反应皮肤过敏试验阳性结果分析[J].中国公共卫生， 1998， 14：77-78．

[7]Solomon WR. Airborne pollen：a brief life[J].J Allergy Clin Immunol， 2002，109：895-900.

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[11] 吴晓蔓， 黄妩娇.艾蒿花粉与豚草花粉的抗原成份分析[J].广东医学，2004，25：1136-1138.

[12] Enberg RN， Leicky FE， Mc Cullough J， et al. Watermelon and ragweed share allergens[J].J Allergy Clin Immunol， 1987， 79：867-875.