响应面法优化枯草芽孢杆菌产γ-聚谷氨酸发酵工艺

贺杨扬，曾 伟，王青龙，王大芸，陈桂光，梁智群

响应面法优化枯草芽孢杆菌产γ-聚谷氨酸发酵工艺

贺杨扬，曾 伟，王青龙，王大芸，陈桂光，梁智群*

（广西大学生命科学与技术学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西 南宁 530004）

以1株谷氨酸依赖型γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）产生菌Bacillus subtilis GXA-28为研究对象，利用响应面法系统优化其γ-聚谷氨酸发酵培养基成分。通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验以及Box-Behnken试验构建响应方程，利用该方程预测得到最优培养基：蔗糖33.65 g/L、酵母膏0.4 g/L、NH4Cl 1.6 g/L、谷氨酸钠15 g/L、 KH2PO40.4 g/L、K2HPO4·3H2O 1.68 g/L、MgSO4·7 H2O 0.1 g/L、MnSO4·H2O 0.04 g/L。利用优化培养基，在40.2℃、160 r/min条件下摇瓶发酵22 h，γ-PGA产量达到16.63 g/L，底物谷氨酸钠转化率比优化前提高了20%，达到100%。

γ-聚谷氨酸；枯草芽孢杆菌；响应面分析；发酵培养基

γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）是自然界中微生物来源的一种强水溶性多聚高分子化合物，它具有良好的生物可降解性、生物相容性、可食用性、低免疫原性、保湿性[1]，对人体和环境无毒无公害，可广泛应用于工业、农业、食品、医药、化妆品等领域[2]。随着γ-PGA在很多新领域中的应用拓展，其相关研究越来越受到人们的关注，尤其是在γ-PGA产生菌选育、发酵工艺优化及生物合成机理方面[1]。目前由于受到发酵工艺条件、生产成本及菌株生产能力等限制，国内尚未见大规模工业化生产的相关报道。

γ-PGA最早由Ivanovics等于1937年在炭疽芽孢杆菌荚膜中发现[1]。1942年Bovarnick等[3]首次发现枯草芽孢杆菌能够分泌胞外γ-PGA，随后发现短小芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌等也能分泌胞外γ-PGA。目前日本等国家已经采用发酵法实现了γ-PGA工业化生产，产量在25～50 g/L[4]。国内相关课题组报道γ-PGA实验室发酵产量约30～40 g/L，底物转化率约70%。发酵过程中由于发酵液黏度较高，严重影响其溶氧水平，进而影响菌体生长和γ-PGA产量。因此，建立完善的、系统的、大规模的生产γ-PGA的工艺是今后国内亟待解决的课题之一。

本实验利用1株耐高温谷氨酸依赖型菌株Bacillus subtilis GXA-28[5]为研究对象，以优化其发酵培养基成分为目标，采用Plackett-Burman（PB）试验[6]筛选出显著影响γ-PGA产量的因素，爬坡试验确定显著因子中心值，Box-Behnken设计[7]构建响应方程，利用该方程预测得到最优培养基。

1 材料与方法

1.1 菌株

本实验室自主筛选枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXA-28，菌株保藏编号CCTCC M2012347。

1.2 培养基

种子培养基（g/L）：葡萄糖10、酵母膏5、谷氨酸钠5、KH2PO40.5、MgSO4·7 H2O 0.1， pH 6.5。

斜面培养基成分同种子培养基，加琼脂粉15 g/L，pH 6.5。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖30、酵母膏2.5、谷氨酸钠20、KH2PO40.5、MgSO4·7 H2O 0.1，pH 6.5。

1.3 培养方法

种子培养：取1 环斜面菌种接于种子培养基中，42 ℃、160 r/min，恒温振荡培养16 h。

发酵培养：按2%接种量吸取种子液接于发酵培养基中，42 ℃、160 r/min，恒温振荡培养22 h。

1.4 测定方法

发酵液中γ-PGA质量浓度测定：参照文献[8]。

pH值测定：采用梅特勒-托利多320酸度计测定。

菌体量测定：发酵液经蒸馏水稀释10倍，660 nm波长处测定吸光度。

残糖测定：采用二硝基水杨酸法[9]。

1.5 发酵条件优化

1.5.1 单因素试验

检测微生物培养基中的营养成分对菌体的生长和产物的积累的影响，主要有碳源、氮源、谷氨酸钠、金属离子等。本试验选用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、柠檬酸、木糖、甘油、白砂糖、可溶性淀粉作为碳源，得到最佳碳源后对其进行质量浓度优化，选取梯度为：10、20、30、40、50、60、70 g/L。选取8 种有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、干酪素、玉米粉、黄豆粉和8种无机氮源：NaNO3、KNO3、NH4Cl、(NH4)2CO3、NH4NO3、NH4HCO3、(NH4)2SO4、尿素。得到最佳氮源后对其质量浓度进行优化，选取梯度依次为：2.5、5、7.5、10、20、30、40 g/L。对底物谷氨酸钠进行优化，选取梯度依次为：10、20、30、40、50、60、70 g/L。通过比较MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、CaCl2、ZnCl2、FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O、(NH4)6MoO24·H2O对γ-PGA产量的影响，选出影响最显著的金属离子。同时发酵条件，如温度、转速、装液量、pH值等对γ-PGA产量也有一定影响。将温度依次设为：32、34、36、38、40、42、44、46 ℃。转速依次设为：120、140、160、180、200、220 r/min。装液量依次设为：25、50、75、100 mL（250 mL三角瓶）。pH值梯度为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5。将各种影响因素在基础发酵培养基的条件上逐一改变，确定每个因素的最佳范围。

1.5.2 PB试验设计

通过单因素试验选出8 个因素：葡萄糖、酵母膏和NH4Cl、谷氨酸钠、MgSO4·7 H2O、KH2PO4、MnSO4·H2O、K2HPO4·3H2O、温度，依次设计为A、B、C、D、E、F、G、H。每个因素2 个水平，高水平（＋）和低水平（－）。

1.5.3 最陡爬坡试验

根据PB设计试验结果选出3 个最显著影响 γ-PGA产量的因素：蔗糖、K2HPO4·3H2O和温度，根据其正负效应设定步长及变化方向，快速逼近最佳响应面区域，其他因素均取低水平。

1.5.4 Box-Behnken设计

运用Box-Behnken中心组合设计原理，以最陡爬坡试验得到的中心点对3 个显著因素进行Box-Behnken设计，各取3 个水平，高水平（＋）、中间水平（0）和低水平（－）。根据Design-Expert 8.0软件设计三因素三水平共17 组试验进行响应面分析。17 组试验分为两类：一类是析因点，共12 个；一类是零点，为区域的中心点。零点重复5 次，用于估计实验误差。

统计学分析每个变量之间的作用以及它们的交互作用，采用下列二次方程进行产量预测。

式中：Y表示响应值，即γ-PGA产量；Xi和Xj表示独立变量；β0为一个固定常数；βi、βii和βij分别表示线性相关系数、平方系数和交互系数。

2 结果与分析

2.1 单因素优化

在单因素试验中，通过比较10 种碳源对γ-PGA产量的影响，选出了最佳碳源为蔗糖，其最适质量浓度为30 g/L。选择8 种有机氮源和8 种无机氮源进行实验，得到最佳有机氮源为酵母膏，最佳无机氮源为NH4Cl，其最适质量浓度均为2.5 g/L。由于有机氮源成本较高，所以将无机氮源NH4Cl替代部分有机氮源，在不影响产量的情况下得到两者的最佳质量配比为1∶4。本实验所用GXA-28是1 株谷氨酸依赖型菌株，底物质量浓度对γ-PGA产量有很 大的影响，经过实验确定最佳底物质量浓度为20 g/L。通过比较不同金属离子对γ-PGA产量的影响，结果表明MgSO4·7H2O和KH2PO4在GXA-28发酵产γ-PGA中是必需的，添加0.1 g/L MnSO4·H2O、0.1 g/L CaCl2和2 g/L K2HPO4·3H2O对其产量有促进，而低质量浓度的FeSO4·7H2O、ZnCl2、FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O和(NH4)6MoO24·H2O对γ-PGA产量均有抑制作用。

2.2 PB试验设计

由于Ca2+与SO42-容易形成微溶物，所以在PB设计中将不选用CaCl2。PB试验结果和方差分析如表1、2所示。

表1 PB试验设计及结果Table 1 Plackett-Burman experimental design and results

表2 PB试验设计的效应评价Table 2 Analysis of variance for the experimental results of Plackett-Burman design

“Prob＞F”小于0.05，说明该因素是显著的，模型 Prob＞F小于0.05，说明实验模型是显著的。A、B、C、E、F和H是正影响，D和G是负影响。本实验选择“Prob>F”小于0.05的3个因素A、G、H（即蔗糖、K2HPO4·3H2O、温度）为显著因素。

2.3 最陡爬坡试验

由PB设计结果可知，蔗糖和温度是正影响，K2HPO4·3H2O 是负影响，爬坡方向及步长根据其正负性确定，如表3所示。结果表明，γ-PGA最大产量出现在试验组2。但考虑到Box-Behnken试验设计的可操作性，蔗糖和温度的中心点确定为32.5 g/L和43 ℃，K2HPO4·3H2O的中心点确定为1.5 g/L。

表3 最陡爬坡试验设计及结果Table 3 Steepest ascent experimental design and results

2.4 Box-Behnken试验设计

表4 Box-Behnken响应面试验设计及结果Table 4 Box-Behnken design and results

对Box-Behnken试验设计及结果如表4所示，对结果进行回归分析，得到如下方程：Y1＝15.31－0.054A＋0.86B－4.27C＋1.99AB－ 0.40AC－0.022BC－2.84A2－2.94B2－3.79 C2。相关系数R2＝0.918 4，说明方程的拟合度很好，可以用该方程进行实验结果预测。

根据表5方差分析数据可知，二次项对响应值的影响是十分显著的，交互项的影响不显著。模型的F值0.004 6远小于0.05，说明该模型是显著的。一般认为，相关系数R2大于0.9说明预测值能与实验值有较高的相关度。本实验中R2为0.918 4，说明仅有大概8%的γ-PGA产量不能由该模型预测。回归方程表明蔗糖33.64 g/L、K2HPO4·3H2O 1.68 g/L、温度40.18℃时，γ-PGA产量预测值可达16.67 g/L。对预测结果进行4次重复实验，得到γ-PGA产量平均值为16.63 g/L，实验值与预测值拟合度高，说明回归方程能够比较真实的预测各因素对γ-PGA产量的影响。

表5 Box-Behnken试验方差分析Table 5 Analysis of variance for the experimental results of Box-Behnken design

回归方程作出的响应面图及等高线图如图1所示。等高线图可直观反映各因素之间的交互作用强弱，椭圆表示两因素交互作用明显，圆形则表示交互作用较小或没有交互作用。

图1 温度、蔗糖和K2HPO4·3H2O添加量对γ-PGA产量的影响Fig.1 Effects of sucrose, temperature and K2HPO4·3H2O on the yield of γ-PGA

2.5 B. subtilis GXA-28发酵过程曲线

图2 2 B. subtilis GXA-28发酵过程曲线Fig.2 Fermentation profiles of B. subtilis GXA-28

发酵过程中，pH值、菌体量、γ-PGA产量及残糖量如图2所示。菌体生长延滞期较短，4 h后即进入对数生长期；16～28 h处于稳定期；30 h后菌体量急速减少，这可能是由于培养基中营养消耗殆尽引起菌体自溶导致的。残糖量在30 h后处于一个稳定的低水平也说明了这一点。γ-PGA合成和菌体生长呈典型偶联型，22 h达到最大值；30 h后开始出现降解，这是由于菌体生长后期分泌γ-PGA降解酶引起的。葡萄糖作为速效碳源，在菌体对数生长期被快速利用，20 h即达到一个较低水平。pH值在整个发酵过程中变化不大，35 h后略有上升。

3 结 论

利用PB设计对蔗糖、酵母膏和NH4Cl、谷氨酸钠、MgSO4·7H2O、KH2PO4、MnSO4·H2O、K2HPO4·3H2O、温度8 个因素进行了二水平12 次试验，从中选出了3 个主要影响因素：蔗糖、K2HPO4·3H2O和温度。通过最陡爬坡试验确定了中心点，进一步用Box-Behnken设计对主要因素进行三因素三水平的17次试验，确定3 个主要因素的最优值，构建响应方程预测γ-PGA最高产量为16.67 g/L。将得到的最优发酵培养基进行4 次验证实验，γ-PGA平均产量为16.63 g/L，实验值与预测值拟合度高，说明响应方程能够比较真实地预测各因素对γ-PGA产量的影响。

近年来，国内外关于γ-PGA优化发酵工艺优化的研究十分活跃。Kubota等[4]利用B. subtilis F-2-01发酵制备γ-PGA，其产量可达到50 g/L，底物转化率为71.43%，该菌株发酵工艺被日本明治公司成功用于工业化生产制备γ-PGA。B. subtilis IFO 3335[10]和B. licheniformis ATCC9945A[11]作为γ-PGA合成代谢途径以及合成酶相关基因研究的模式菌株，其γ-PGA产量分别达到20 g/L和23 g/L，底物转化率分别为40%和23%。Bajaj等[12]对B. licheniformis NCIM 2324发酵工艺进行优化后，γ-PGA产量达到26.12 g/L，底物转化率为41.9%。Shi Feng等[13]对B. subtilis ZJU-7进行优化后，γ-PGA产量为54 g/L，底物转化率为38.6%。Xu Hong等[14]优化B. subtilis NX-2发酵培养基菌株，得到γ-PGA产量为41 g/L，底物转化率为41%。Wei Xuetuan等[15]对菌株B. licheniformis WX-02进行优化，其γ-PGA产量为13 g/L，转化率为35.2%。本实验所采用的菌株B. subtilis GXA-28，优化后γ-PGA产量达到16.63 g/L，高出优化前20%，优化后底物谷氨酸钠的转化率达到了100%，高于上述相关报道γ-PGA底物转化率30%～60%。

相对于传统的单因素试验和正交试验，响应面法优化发酵培养基的实验次数少、周期短，不仅能够对影响因素作出正确的评价，还能够充分体现几个主要影响因素的交互作用，从而快速有效地得到最佳条件。目前国内在利用响应面法优化生物反应过程方面、物质提取方面取得良好的结果[16-20]，由此表明采用响应面法优化发酵工艺是提高产量的有效途径。

[1] SHIH I L, VAN Y T. The production of poly-(γ-glutamic acid) from microorganisms and its various applications[J]. Bioresource Technology, 2001, 79: 207-225.

[2] ASHIUCHI M. Occurrence and biosynthetic mechanism of polygamma-glutamic acid[M]//Amino-acid homopolymers occurring in nature. Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2010: 77-93.

[3] BOVARNICK M. The formation of extracellular D-glutanmic acid poypeptide by Bacillus subtilis[J]. Journal of Biotechnology and Biochemistry, 1942, 145: 415-424.

[4] KUBOTA H, MATAUNOBO T, UOTANI K, et al. Production of poly (γ-glutamic acid) by Bacillus subtilis F-2-01[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1993, 57(7): 1212-1213.

[5] ZENG Wei, LIN Yuanshan, QI Zongxian, et al. An integrated highthroughput strategy for rapid screening of poly(γ-glutamic acid)-producing bacteria[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97: 2163-2172.

[6] HACKER R L, BURMAN J P. The design of optimum multifactorial experiments[J]. Biometrika, 1946, 33: 305-325.

[7] BOX G E P, BEHNKEN D W. Some new three level designs for the study of quantitative variables[J]. Technometrics, 1960, 2: 455-475.

[8] ZENG Wei, CHEN Guiguang, ZHANG Yunkai, et al. Studies on the UV spectrum of poly(γ-glutamic acid) based on development of a simple quantitative method[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2012, 51: 83-90.

[9] MILLER G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemisty, 1959, 31(3): 426-428.

[10] KUNIOLA M, GOTO A. Biosynthesis of poly(γ-glutamic acid) from L-glutamic acid, citric acid, and ammonium sulfate in Bacillus Subtilis IFO3335[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1994, 40: 867-872.

[11] CROMWICK A M, GROSS R A. Effect of manganese (Ⅱ) on Bacillus licheniformis ATCC9945A physiology and γ-poly (glutamic acid) formation[J]. International journal of Radiation Oncology Biology Physics, 1995, 16: 265-275.

[12] BAJAJ I B, LELE S S, SINGHAL R S. A statistical approach to optimization of fementative production of poly(γ-glutamic acid) from Bacillus licheniformis NCIM 2324[J]. Bioresource Technology, 2009, 100: 826-832.

[13] SHI Feng, XU Zhinan, CEN Peilin. Optimization of γ-glutamic Acid Production by Bacillus subtilis ZJU-7 using a surface-response methodology[J]. Biotechnolgy and Bioprocess Engineering, 2006, 11: 251-257.

[14] XU Hong, JIANG Min, LI Hui, et al. Effi cient production of poly(γglutamic acid) by newly isolated Bacillus subtilis NX-2[J]. Process Biochemistry, 2005, 40(2): 519-523.

[15] WEI Xuetuan, JI Zhixia, CHEN Shouwen. Isolation of halotolerant Bacillus licheniformis WX-02 and regulatory effects of sodium chloride on yield and molecular sizes of poly-gamma-glutamic acid[J]. Applied Biohemistry and Biotechnology, 2010, 160(5): 1332-1340.

[16] 王普, 孙立明, 何军邀. 响应面法优化热带假丝酵母104菌株产羰基还原酶发酵培养基[J]. 生物工程学报, 2009, 25(6): 863-868.

[17] 李浩, 任嘉红, 叶建仁. 响应面法优化生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007的发酵工艺[J]. 生物工程学报, 2013, 29(2): 243-246.

[18] 陈苓, 刘会平. 响应面法优化再制干酪乳化盐配方[J]. 食品科学, 2013, 34(8): 321-325.

[19] 赵延伟, 王雨生, 陈海华, 等. 响应面法优化豆粕酶解工艺条件[J].食品科学, 2013, 34(8): 70-75.

[20] 侯学敏, 李林霞, 张直峰, 等. 响应面法优化薄荷叶总黄酮提取工艺及抗氧化活性[J]. 食品科学, 2013, 34(6): 124-128.

Optimization of Medium Composition and Fermentation Conditions by Response Surface Methodology for the Production of Poly-γ-Glutamic Acid by Bacillus subtilis

HE Yang-yang, ZENG Wei, WANG Qing-long, WANG Da-yun, CHEN Gui-guang, LIANG Zhi-qun*
(State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China)

Poly-γ-glutamic acid, as a high molecular polymer produced by microorganism, is widely used in industry, agriculture, food, medicine and cosmetics. This study aimed to use response surface methodology for a systematic optimization of fermentation medium composition for the production of poly-γ-glutamic acid by a glutamic aciddependent strain of Bacillus subtilis GXA-28. A response surface regression equation was established based on the results of one-factor-at-a-time, Plackett-Burman, steepest ascent and Box-Behnken experimental designs. The optimal medium formulation, as predicted from the equation, consisted of 33.65 g/L sucrose, 0.4 g/L yeast extract, 1.6 g/L NH4Cl, 15 g/L monosodium glutamate, 0.4 g/L KH2PO4, 1.68 g/L K2HPO4·3H2O, 0.1 g/L MgSO4·7H2O and 0.04 g/L MnSO4·H2O. The yield of poly-γ-glutamic acid reached 16.63 g/L, which was 20% higher than before the optimization, and the conversion rate of the substrate glutamate reached 100% by using the optimized medium at 40.2 ℃ with shaking at a speed of 160 r/min for 22 h.

poly-γ-glutamic acid; Bacillus subtilis; response surface analysis; fermentation medium

TS201.3

A

1002-6630（2014）09-0147-05

10.7506/spkx1002-6630-201409030

2013-06-23

国家自然科学基金地区科学基金项目（21062001）；广西研究生教育创新计划资助项目（YCBZ2012004）

贺杨扬（1989—），女，硕士研究生，研究方向为微生物工程。E-mail：15977108825@163.com

*通信作者：梁智群（1959—），男，教授，博士，研究方向为食品生物化学。E-mail：zqliang@gxu.edu.cn