柱层析分离甲基托布津粗品中杂质的研究

季彩宏，糜 亮，杨丽珍

(1.扬州职业大学，江苏 扬州 225009;2.江苏省特种设备安全监督检验研究院扬州分院，江苏 扬州 225002)

甲基托布津(简称甲托)系高效、低毒、广谱的内吸性杀菌剂，对小麦赤霉病、水稻纹枯病等农作物病虫害有良好的防治效果［1］。合成的甲托常常会出现产品质量和收率不稳定，这主要是由杂质引起的。本文采用柱层析分离和薄层层析监控对甲托进行杂质分离，用液谱色谱分析相结合的方法对杂质结构进行确定。

1 仪器及试剂

1.1 仪器

WR S-1 B 数字熔点仪;层析柱(2. 5cm ×50cm);氮吹仪;三用紫外分析仪;岛津液相色谱仪(LC-20AT 型，含紫外检测器和自动进样器);Bruker-400 MHz 核磁共振仪，美国热电公司LCQ Deca XP Max 液质联用仪配有Finnigan Surveyor PDA 紫外可见二极管阵列检测器、ESI/APCI 离子源和离子阱质量分析器。

1.2 试剂

毛细管;硅胶G(80 -100 目)(青岛海洋化工厂);薄层板(青岛海洋化工厂);柱层析用乙酸乙酯，石油醚分析纯(国药集团);甲基托布津合成粗品(自制)。

2 实验方法

2.1 甲托合成方法

邻苯二胺和异硫氰基甲酸甲酯按一定比例混合，选择适当的催化剂和温度反应，经处理后得到甲托粗品。

2.2 展开剂选择

甲托粗点用乙酸乙酯溶解后，在活化好的薄层上进行点样，然后放进展开剂中展开。在紫外分光仪下观察样板，记录各点的位置，计算Rf 值，确定最佳展开剂。

2.3 柱层析分离

将105℃烘干的硅胶边搅拌边加入石油醚中，装到层析柱2/3 处，将填入的硅胶压实。

把甲托粗品用乙酸乙酯溶解，用胶头滴管吸取均匀填料，从层析柱顶口慢慢均匀的加在石英砂上。待石油醚液面高于硅胶面3.0cm 左右时，加入洗脱液，控制洗脱流速为0.7 - 1.2mL·min-1。每10mL 收集1 个洗脱份，氮气吹干溶剂后，用定量甲醇溶解后进行液相色谱分析。

2.4 检测条件

C18 色谱柱:4.6mm ×250mm，5μm，流动相为甲醇∶纯水=50∶50(v/v)，蒸馏水在使用前用超声脱气，载液流速为1mL·min-1，柱温为30℃;进样量为5mL，紫外检测波长为269nm。

3 结果与讨论

3.1 展开剂的极性选择

影响薄层层析分离效果的主要因素有被分离物质的极性、吸附剂的极性和展开剂的极性。分离对象甲托和杂质的极性与硅胶的吸附性能都是一定的，因此主要通过调变展开剂的性质来提高组分的分离效果［2］。根据溶剂极性表中常用溶剂的极性大小，要求展开剂对所分离物质具有良好的溶解性，与待测组分的Rf 值 在0.2 ～0.8 之间，且不与待测组分或吸附剂发生化学反应，沸点适中，黏度较小。复配了乙酸乙酯和石油醚进行实验比较:乙酸乙酯∶石油醚分别为7∶10、3∶2、1∶1、2∶1，分离结果见图1。

图1 不同比例展开剂中薄层色谱分析

因为乙酸乙酯的极性比石油醚大，当石油醚比例较高时，展开剂极性较弱，两物质洗脱速度较慢，而且不易分开，当乙酸乙酯比例较高时，两物质洗脱速度太快，分离度也不好，于是在这两个极端极性中进行调配，当乙酸乙酯∶石油醚=3∶2时，效果最佳。

3.2 柱层析分离

柱层析分离物质利用混合物中各种物质的极性不同，从而在层析柱中以不同的流速流下，在柱内形成一些移动的谱带，每一条谱带中含有一个单一的化合物，这样就可以收集所要的纯净的物质［3-5］。由于甲托样品几乎是白色，所以，通过液相色谱来检测，检测前必须用氮吹仪吹干溶剂后用适量甲醇溶解后再进样。图2 为分离前甲托原样的液谱图，甲托原样在9.3min(保留时间)出峰，含量为91.63%，7.4min(保留时间)出峰，主要杂质含量6.40%，其他杂质和基线影响含量为1.97%。图3 为柱层分离过程中收集到的物质的液相谱图，(a)为甲托峰，保留时间为9. 7min，(b)为甲托和杂质过液态峰，(c)为杂质峰，保留时间为7.4min。

杂质高温易分解，因此氮吹温度为室温，杂质需经多次分离富集。

3.3 杂质结构的认定

由于观察分离后的化合物的颜色，晶形，熔点都与甲托纯品比较相似，所以，必须借助其他手段进行分析。

图2 甲托分离前原样液谱图

图3 柱层析收集的物质的液谱分析

3.3.1 杂质的1H NMR 谱图

图4 杂质的1H NMR 谱图

由图4 可知，杂质主要几个结构(7.063 ～8.402)是芳环上共轭的3H 为多重峰，(4.105 -4.140)是N -H 的多重峰，(3.489 -3.861)甲基上的氢，由特殊软件分析甲托分子结构和猜测的杂质结构上的氢极性数据(见图5)，可以推算出杂质与甲托的1H NMR 谱图相差很细微。

图5 结构与氢极性数据

3.3.2 杂质的HPLC-MS 分析

甲托和杂质的HPLC—MS 谱图见图6，其中m·z-1为质核比。由杂质的质谱图可知，349.02 是分子离子峰即［M+Na］+峰，该化合物的相对分子质量为326，而由甲托质谱图365.02 是分子离子峰即［M +Na］+峰，即该化合物的相对分子质量为342，考虑到杂质的分子量比甲基硫菌灵小16，那么可能的结构有两种情况:一是甲基硫菌灵分子中的一个硫原子被氧原子替代;二是甲基硫菌灵分子中一个氧原子丢失，即一个-OCH3被-CH3替代。结合生产实际，认为在生产过程中甲基硫菌灵分子结构中的碳硫双键被氧化为碳氧双键。从上述分析得出的杂质的结构来看，其杂质可能的来源有:(1)反应使用的原料不纯，导致产生杂质产物;(2)反应过程中发生副反应(水解或者氧化)，使得甲基硫菌灵分子结构中的碳硫双键变成碳氧双键，那么尽量创造无氧的反应条件。

图6 杂质和甲托的质谱图

4 结论

通过TLC 确定最佳展开剂体系，TLC 实验最佳的展开剂体系的体积比为:乙酸乙酯∶石油醚=3∶2。柱层析分离杂质的适宜条件:0.5mL 的粗品上硅胶(80 -100 目)的层析柱，流动相为乙酸乙酯∶石油醚(3∶2，V/V)，流速为0.9mL·min-1。通过对1H NMR 和HPLC-MS 图谱及其解析可知，杂质的分子量比甲基硫菌灵小16，结合生产实际，我们认为在生产过程中甲级硫菌灵分子结构中的碳硫双键被氧化为碳氧双键了。其杂质可能的来源有:(1)反应使用的原料不纯，导致产生杂质产物;(2)反应过程中发生副反应(水解或者氧化)，使得甲级硫菌灵分子结构中的碳硫双键变成碳氧双键，应注意调整反应的条件。

［1］ 吴春芳，安焕霞. 不同浓度的甲基托布津防治松针褐斑病药效试验［J］.山东林业科技，2011(4):72 -73.

［2］ 何志昂，王权.浅谈TLC 中展开剂的选择［J］.中国高新技术企业，2009(7):44 -45.

［3］ 凌伟军，余倩，黄淋佳，等.柱层析分离提纯麝香草酚的研究［J］.食品工业科技，2010(7):242 -244.

［4］ 夏向东，吕飞杰，台建祥，等.硅胶和硝酸银硅胶柱层析分离生育酚与生育三烯酚［J］.中国粮油学报，2004(19):85 -88.

［5］ 何书海，李腾崖，陈菲.高效液相色谱法对环境样品中甲基托布津与甲霜灵残留的测定［J］. 分析测试学报，2010(2):85 -88.