大白菜核不育雄蕊败育超微结构观察

2014-01-20高宏秀

浙江农业科学 2014年2期

关键词：花药细胞质空泡

高宏秀,张莹

（江苏徐州生物工程职业技术学院,江苏徐州 221006）

大白菜核不育雄蕊败育超微结构观察

高宏秀,张莹

（江苏徐州生物工程职业技术学院,江苏徐州 221006）

以大白菜雄性不育近等基因系为材料,运用TEM技术进行雄蕊发育过程中的绒毡层细胞的超微结构研究。结果显示,在四分体时期,可育花药绒毡层细胞开始横向增大,细胞核清晰可见,核仁染色很深,细胞质内出现大小不一致的囊泡；淀粉类物质聚集成哑铃形、球形等多种形状。此时绒毡层细胞细胞膜较薄,细胞之间排列紧密；而同时期的不育花药绒毡层开始膨大,出现许多小空泡,细胞膜明显变厚,随后绒毡层向药腔伸展,出现多层细胞,有的细胞空泡化严重；细胞质内部未见细胞核和细胞器,也未见糖类物质。有的细胞局部空泡化,细胞质内含有少量的含油体和线粒体,由于糖类物质较少,细胞质比较清晰。说明绒毡层的结构异常导致无法提供给小孢子发育所需的营养物质,最终导致雄蕊败育。

大白菜；核不育；超微结构观察

雄性不育（malesterility,MS）是指植物在遗传、环境（温度和光照等因素）等因子的影响下雄性器官退化,发育不良或花粉、精子败育不能够行使生育能力而雌蕊却发育正常的现象［1］。这种现象在植物界普遍存在。在高等植物中,约有43科162属320种约620个品种或种间杂交种具有雄性不育现象［2-3］,并在新的科学技术手段的运用过程中,创造了一批人工雄性不育体。雄性不育系主要是利用天然具有杂种优势的植株作为母本,省去人工去雄的烦琐工作,便于大规模的杂交制种,为生产上大规模利用杂种1代优势创造有利条件,这样不但能够生产出具有较高纯度的商业杂交种,还具有较强的知识产权保护功能。自1921年Bateson等首先在亚麻（Linumusitatissimum）中发现雄性不育以来,植物雄性不育机理的研究一直是一个热门课题。

大白菜（BrassicacampestrisL.ssp.chinensis Makino）原产于我国北方地区,是十字花科芸薹属芸薹种叶用蔬菜,素有“菜中之王”的美称,其栽培面积和消费量在我国居各类蔬菜之首。大白菜为两性花异花授粉,杂种优势十分明显。由于花器官比较小,单花结籽量很少,而单位面积的播种量又较大,人工授粉制种难以大面积地实现其杂种优势的商业化应用。大白菜的遗传背景比较简单,不育株和可育株仅受1对隐性基因控制,可在较短时间内将显性目的基因固定到杂交1代上,且F1代的营养器官是大白菜育种利用的主要部位,可不经过育性恢复直接用于生产,因此大白菜雄性不育系利用一直被认为是目前F1代杂种生产的理想途径。

关于核基因雄性不育系的遗传机制的早期研究认为,不育性是由核内一对隐性基因控制,也有人提出是由1对显性基因控制。通过测交筛选法发现,这两类不育材料都找不到完全的保持系,只能获得不育株率稳定在50%的两用系。用两用系配制商业杂交种,必须在开花前拔除可育株,增大了制种成本；在大面积制种时,杂种纯度难以保证。20世纪90年代,大白菜核基因雄性不育研究工作有了重大的突破。100%不育植株率的核不育材料选育成功,并对该类核不育材料的遗传机制进行摸索,获得了一系列遗传假说。

张书芳等［4］通过对小青口、二青帮、青帮河头等品种的杂交筛选,获得了不育株率稳定在50%左右的不育系统,但这种两用系（既可作不育株也可作可育株）在生产应用中面临着不育株育性不稳定的问题,需进一步改良后才有可能应用于生产。VanDerMeer等［5］在用大白菜品种Granaat和Pavchoi杂交的F1代中发现不育株,用Monument品种回交育成了显性控制不育性的核不育材料。张书芳等［4］在农家品种万泉青帮中发现了显性不育基因（Sp）及其显性上位基因（Ms）,并找到了临时保持系,育成了具有100%不育株率的雄性不育系88-1A。魏毓棠等［6］也获得了类似的核不育体系。冯辉［7］等获得雄蕊退化彻底、不育株率和不育度均为100%的复等位基因控制的大白菜核不育材料,并提出了大白菜核基因雄性不育“复等位基因遗传假说”。该类不育系既不存在细胞质雄性不育系的胞质负效应,也不存在制种时拨除可育株的问题,是一种较为理想的雄性不育系［8］。核不育花药的细胞学研究主要就是为了研究花粉败育的过程,这样可将核不育分子水平研究和个体调控育性变化的研究联系起来,有利于全面认识核不育机理。

本研究以大白菜核不育近等基因系为材料,运用电镜超薄切片技术手段对材料花药的发育进行研究,预期获得大白菜核不育花药的确切败育时间以及败育特点,并为大白菜核不育的细胞凋亡检测提供细胞学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大白菜核不育近等基因系L3,可育株基因型MsfMs,不育株基因型MsMs,遗传稳定,系统内兄妹交后代育性保持1∶1分离,由云南农业大学大白菜课题组选育而成。

1.2 试验方法

透射电镜切片观察于盛花期,按花蕾在花序上的位置连续取样,每样设3个重复,将材料迅速投入2.5%戊二醛固定液中固定。（1）前固定。50mmol·L-1pH值7.4的磷酸钠缓冲液,含2.5%的戊二醛。室温固定6h,磷酸钠缓冲液漂洗3次,每次30min。（2）后固定。1%四氧化钠,50mmol·L-1pH值7.4的磷酸钠缓冲液中, 4℃固定12h,磷酸钠缓冲液漂洗3次,每次30 min。（3）脱水。用30%,50%,70%,80%, 90%的酒精逐级脱水,每级20min,100%酒精脱水3次,每次30min。（4）渗透。花药放在酒精∶树脂为2∶1中,室温下渗透2h；酒精：树脂为1∶1中渗透5h；酒精∶树脂为1∶2中渗透12h；纯树脂中渗透48h,中间换1次新鲜配制的树脂。（5）包埋和聚合。用牙签轻轻挑起花药,然后放入预先装满包埋树脂的包埋板上的小凹槽中,并使组织块位于小凹槽的最右端,按照切片的要求调整组织块的方向,在恒温箱中60℃条件下聚合48h。（6）切片。用LeicaEMTRIM修块机修快,在LeicaEMUC6超薄切片机上切片,厚度90nm,用75目铜网作载网捞取连续切片。（7）染色。醋酸双氧铀和柠檬酸铅在室温下双染色各20min。（8）观察。载网于JEM-1200EXⅡ型透射电镜下80kV观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 可育花药发育过程结构观察

通过前期对大白菜可育花药的石蜡切片观察,在四分体之前绒毡层细胞发育正常。进一步用透射电镜切片观察大白菜核可育花药雄蕊四分体时期至花粉成熟期绒毡层的结构。

在四分体时期,随着药腔的发育,绒毡层细胞开始横向增大,细胞核清晰可见,核仁染色很深,细胞质内出现大小不一致的囊泡；淀粉类物质聚集成哑铃形、球形等多种形状。此时绒毡层细胞细胞膜较薄,细胞之间排列紧密（图1中A,B）。在单核小孢子时期,绒毡层细胞已有局部横向伸长,细胞质清晰,细胞质内有液泡、小囊泡、淀粉粒等细胞器,细胞核染色较浅,核仁染色较深,液泡可见（图1中C）。随后绒毡层细胞纵向皱缩,横向扩张,发展成为细长型细胞,细胞开始出现大量的空泡化现象,细胞内部的糖类物质积累增多,细胞壁已经不明显,但是还存在明显的细胞轮廓,同时细胞间隙也不断加大（图1中D）。最后在花粉即将成熟时,绒毡层则降解明显,绒毡层已经没有明显细胞轮廓,绒毡层含有丰富的营养物质,细胞内存在淀粉粒和核小体（图1中E）,当花粉完全成熟时,绒毡层完全降解,花药内壁细胞成为一个空细胞,细胞内部细胞质、细胞器都基本消失,细胞壁也变薄（图1中F）。

2.2 不育花药发育过程结构观察

通过前期对大白菜可育花药的石蜡切片观察,不育花药的绒毡层在四分体时期异常发生,随后进一步用透射电镜切片观察大白菜核败育花药四分体时期至花粉成熟期绒毡层的结构。

图1 可育花药超微结构

图2 不育花药超微结构

在四分体时期,药绒毡层开始膨大,出现许多小空泡,细胞质中可以看见小囊泡、含油体等细胞器,细胞核和核仁可见,但染色较浅,此时细胞壁明显变厚（图2中A）。随后的小孢子向成熟期发育过程中,绒毡层向药腔扩增,出现多层细胞,有的细胞空泡化严重,细胞质内部已经没有细胞核和细胞器了,也未见糖类物质；而有的细胞局部空泡化,细胞质内含有少量的含油体和线粒体等细胞器,但是糖类物质较少,细胞质比较清晰（图2中B）。在小孢子发育后期,绒毡层细胞的空泡化更加严重,细胞被空泡占据大部分空间,细胞质较少,可见个别线粒体,但其他细胞器和质体已经很难发现了,同时细胞也开始变得不规则,在接下来的发育中绒毡层也开始皱缩,细胞变得很不规则,细胞的细胞壁开始变薄,细胞内部得高度空泡化,基本不具备活细胞的特征（图2中C）。至花粉成熟期,绒毡层完全皱缩退化,已观察不到绒毡层细胞了,此时花粉粒也降解完全,花药全部败育（图2中D）。

3 小结与讨论

绒毡层处于花药结构的最内层,与小孢子直接接触,所以绒毡层细胞对小孢子的形成和发育起到至关重要的作用。对大多数植物而言,绒毡层的功能主要是产生和输送给小孢子正常发育所必需的酶、生长素和营养物质。从结构水平来讲,绒毡层的发育特征表现为顺序的细胞结构的消除。绒毡层的分化及之后的退化与减数分裂后的花药发育成熟相协调一致。从细胞水平来讲绒毡层细胞是一种特殊的分泌细胞,绒毡层在小孢子母细胞完成减数分裂后能适时地分泌胼胝质酶,分解四分体周围的胼胝质壁,促使其释放小孢子。由于绒毡层合成与分泌胼胝质酶具有时间和空间特异性,在有花植物花粉的正常发育中起着极其重要的决定作用。所以绒毡层的任何变化,都可能影响到小孢子的正常发育,从而导致雄性不育。正常的绒毡层细胞,在减数分裂时期细胞之间连接松弛,减数分裂结束后开始解体,随着花粉的逐步成熟而逐渐退化,仅留残片。绒毡层发生功能失常,常被认为是花粉败育的主要原因。如绒毡层提早成熟或解体、绒毡层增生或肥大、绒毡层不解体或推迟解体均可引起雄性不育。对本试验材料在电镜切片中发现,在四分体时期绒毡层开始膨大,出现空泡化,中层细胞开始退化,变成细长中空的细胞,细胞壁明显变厚。随后的小孢子向成熟期发育过程中,绒毡层向药腔扩增,出现多层细胞,有的细胞空泡化严重,细胞质内部已经没有细胞核和细胞器了,也没有糖类物质；有的细胞局部空泡化,细胞质内含有少量的含油体和线粒体等细胞器,但是糖类物质较少,细胞质比较清晰,这和可育性好的花药同时期的结构差异较大,最明显的标志就是供给小孢子发育的糖类物质基本不存在,当然也无法释放给小孢子,所以绒毡层结构的异常以及其部分功能的丧失,最终引起小孢子败育。

大白菜核不育雄蕊败育与花药绒毡层细胞结构异常密切相关,绒毡层空泡化并异常膨大,细胞内的囊泡、线粒体、糖类物质都不断减少,绒毡层提前解体,导致营养物质不能运输到小孢子中去,小孢子不能继续发育而最终败育。

［1］耿三省,王志源,蒋健箴.辣椒雄性不育系小孢子发生的细胞学观察［J］.园艺学报,1994,21（2）：165-169.

［2］谭婷婷,刘立锋,陈伟.利用分子标记鉴定萝卜细胞质雄性不育种质的研究［J］.山东农业科学,2011（8）：8-13.

［3］冯骋宇.大白菜核基因雄性不育系定向转育研究［D］. 2006,沈阳：沈阳农业大学.

［4］张书芳,宋兆华,赵雪云.大白菜细胞核基因互作雄性不育系选育及应用模式［J］.园艺学报,1990,17（2）：117-125.

［5］ VanDerMeerQP,高书国.大白菜的染色体单基因显性雄性不育性［J］.中国蔬菜,1991（5）：54.

［6］魏毓棠,冯辉.大白菜雄性不育遗传规律的研究［J］.沈阳农业大学学报,1992,23（3）：260-266.

［7］冯辉.大白菜核基因雄性不育性的研究［D］.沈阳：沈阳农业大学,1996.

［8］余凤群,傅廷栋.甘蓝型油菜几个雄性不育系花药发育的细胞形态学研究［J］.武汉植物学研究,1990,8（3）：209-216.

（责任编辑：张瑞麟）

S634.1

0528-9017（2014）02-0197-03