弥勒蔗区甘蔗宿根矮化病发生分布及病原检测

薛 晶，何文志，张会华，马泽辉，杨晓丽，俞德洪，杜迎春

（云南省弥勒市糖业办公室，弥勒652300）

弥勒蔗区甘蔗宿根矮化病发生分布及病原检测

薛 晶，何文志，张会华，马泽辉，杨晓丽，俞德洪，杜迎春

（云南省弥勒市糖业办公室，弥勒652300）

为明确云南弥勒蔗区甘蔗宿根矮化病（RSD）的分布、发生危害情况，对云南弥勒蔗区RSD的发生和分布进行了调查和田间采样，采用PCR法对田间采集的60个样本进行RSD检测。结果表明：52个样本为阳性，阳性检出率86.67%，确认弥勒蔗区存在RSD；通过系统分析，明确了不同品种、不同植期、不同蔗地RSD发生状况，为弥勒蔗区推广应用温水脱毒健康种苗、有效防控甘蔗宿根矮化病提供了科学依据。

甘蔗宿根矮化病；发生；检测

甘蔗宿根矮化病由一种棒杆菌属细菌（Leifsonia xyli subsp.xyli，Lxx）寄生于蔗株维管束中引起，主要通过带病蔗种和收获、砍种刀具等传播蔓延，且传播性极强[1-3]。此病属维管束病害，用一般的物理、化学方法难以消除，有效的防治方法是生产、繁殖和推广脱毒健康种苗，已在澳大利亚、美国、巴西、古巴、南非、菲律宾及我国台湾省等地应用多年[1，4-5]。摸清蔗区甘蔗宿根矮化病的分布、发生危害情况，是科学推广脱毒健康种苗、有效防控甘蔗宿根矮化病的关键。弥勒作为中国和云南省甘蔗生产优势区域市，至今未对甘蔗RSD进行全面调查，尤其近年来，在甘蔗生产快速发展中，甘蔗品种改良更新加快，种植制度多样化，而作为影响甘蔗生产的重要病害甘蔗RSD的分布、发生危害和各主栽品种的感病程度等情况均不清，推广应用脱毒健康种苗、有效防控甘蔗RSD缺乏可靠依据。为此，我们于2013年对弥勒甘蔗主产乡镇RSD的发生和分布进行了调查和田间采样，采用PCR检测技术进行RSD检测，分析明确了弥勒蔗区RSD的分布、发生危害和各主栽品种的感病程度等情况，为推广应用脱毒健康种苗、有效防控甘蔗RSD提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查与样品采集

于2013年1月9—10日甘蔗成熟期，对云南弥勒朋普、竹园、江边、巡检司等甘蔗主产乡镇宿根矮化病的发生和分布进行了调查和田间采样。采样选择具有代表性的主栽品种，根据品种、植期分类，采用5点取样法取样，共采集60个样本。每个样本取10株，每株截取中下部茎节各1节，每节切成约7 cm长，纵向“十字”剖为4份，再用钳子挤压蔗茎，共取约25 mL的蔗汁于50 mL离心管内混匀，样品放于冰箱中，于-20℃保存待用。每取1个样品后，取样工具先用清水冲洗，再用75%的酒精进行消毒。RSD阳性对照由云南省甘蔗遗传改良重点实验室鉴定保存，阴性对照为50±0.5℃热水处理2h的无菌蔗株，空白对照为灭菌去离子水。

1.2 PCR检测

1.2.1 引物设计引物序列采用已报道的RSD病原细菌Lxx 16S～23S rDNA基因间隔区特异引物[6]，预期扩增片段大小为438 bp（上游引物Lxx1：5＇-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3＇；下游引物Lxx2：5＇-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3＇），委托上海生工生物技术有限公司合成。

1.2.2 蔗汁总DNA的提取用改进的CTAB法提取蔗汁总DNA[7]。每个样品取2mL蔗汁放入离心管中，12000r/min离心10min，弃上清；沉淀加入300μL灭菌去离子水稀释混匀；加入600μL经65℃预热的2% CTAB抽提缓冲液，65℃水浴1h（期间每隔20min摇匀1次）；加入600 μL氯仿/异戊醇（24∶1）剧烈振荡30s，12000r/min离心10min；取上清液700μL置于新的1.5mL离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）温和地混匀，12000r/min离心10min；取上清液650μL置于新的1.5mL离心管中，加入2/3体积（455μL）的异丙醇，混匀后置-20℃冰箱中沉淀4h或过夜；4℃下12000r/min离心10min；弃上清液，沉淀分别用400μL预冷的70%乙醇和冷无水乙醇各洗1次；室温下风干，溶于30μL双蒸水中（用手指轻弹离心管使沉淀悬浮），-20℃保存。

1.2.3 PCR扩增和结果判别以抽提的蔗汁总DNA为模版，采用天根生化科技（北京）有限公司的Taq PCR MasterMix进行PCR扩增。扩增体系20μL：ddH2O 8.6μL，2×PCR Taq mix 8μL，DNA模板3μL，上下游引物各0.2μL（20μg/μL）；扩增程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸5min。PCR扩增结果判别：取10μL PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增到438bp条带的为阳性，未扩出438bp条带的为阴性；根据目的片段条带亮度的强弱进一步判别样品带菌浓度的相对高低，条带较亮的样品为强阳性、一般的为中阳性，较弱的为弱阳性。

2 结果与分析

2.1 各主产乡镇（基地）RSD发生情况

采用RCR检测方法，对采自云南弥勒朋普、竹园、江边、巡检司4个甘蔗主产乡镇（基地）的60个样本进行RSD检测。结果表明，弥勒蔗区RSD发生普遍，60个样品中52个呈阳性，阳性检出率为86.67%；其中强阳性样品37个，占61.67%；4个甘蔗主产乡镇均检测出RSD，阳性检出率83.33%～91.67%，检出率最高的是江边乡91.67%、其次是朋普镇86.96%、巡检司镇85.71%、竹园镇83.33%（表1）。

2.2 不同品种RSD发生情况

从检测结果看，弥勒蔗区闽糖69-421、ROC16、ROC22、ROC26四个主栽品种均严重发病，发病率分别为93.33%、76.92%、86.67%和87.50%；强阳性率分别为66.67%、69.23%、86.67%、62.50%。此外，5个主推品种云蔗03-258、福农91-21、ROC96-38、云蔗99-91、云蔗03-194也全部感染RSD（表1）

2.3 不同植期、蔗地RSD发生情况

从表1可看出，植期上1、2、3、4、5年均不同程度发病，但不同植期之间发病率和发病程度都没有明显的规律性。旱地、水田均发病。其中，旱地蔗样品阳性检出率为91.18%；水田蔗样品阳性检出率为88.46%，旱地蔗发病率比水田蔗稍高。

表1 不同情况下甘蔗宿根矮化病发生情况

3 结论与讨论

3.1 甘蔗宿根矮化病在弥勒蔗区普遍发生且发病率高。弥勒市的朋普、竹园、江边、巡检司4个主产乡镇蔗区均检测出RSD，供检测的60个样品中，有52个样品为阳性，阳性检出率高达86.67%，其中强阳性样品为37个，占61.67%。检测结果表明，RSD在弥勒市蔗区发生普遍且严重；4个主栽品种均严重发病，发病率76.92%～93.33%，5个主推品种也全部感染RSD；植期上1、2、3、4、5年均不同程度发病，但不同种植年限间发病率和发病程度都没有明显的规律性；水田、旱地均发病，其中旱地比水田发病率稍高。

3.2 弥勒蔗区应大力示范推广种植温水脱毒健康种苗。结合我们2008—2012年温水脱毒健康种苗试验和生产示范结果，无论新植蔗、宿根蔗，一级健康种、二级健康种、三级健康种均有不同程度增产，增幅10%～35%[8]。因此，根据甘蔗宿根矮化病检测结果，在蔗区推广应用甘蔗温水脱毒健康种苗将会获得较好的社会、经济效益，可有效地防治甘蔗宿根矮化病的传播，提高甘蔗单产15t/hm2左右，延长甘蔗宿根年限1～2年。甘蔗温水脱毒健康种苗是目前甘蔗生产上最具潜力和增效的甘蔗科技重要措施，因此，要认真组织做好甘蔗温水脱毒健康种苗生产、繁殖、示范工作，建立甘蔗温水脱毒健康种苗的生产与应用推广技术体系及相应技术规程，在生产上加快示范推广，大幅度提高甘蔗的单产、延长宿根年限，从而提高甘蔗生产的经济效益，以此解决甘蔗生产特别是宿根甘蔗低产、宿根年限短、生产成本高，效益差的问题。

3.3 强化甘蔗温水脱毒健康种苗繁殖示范基地建设。依托弥勒甘蔗新品种新技术示范基地（位于朋普镇朋普村，面积20hm2）和云南省农业科学院甘蔗研究所第三科研基地（位于朋普镇黑果坝村，面积18hm2），建设甘蔗温水脱毒健康种苗繁殖示范基地一级种苗圃；在蔗区4个乡镇6hm2以上甘蔗种植大户建设甘蔗温水脱毒健康种苗基地二、三级种苗圃，由二、三级健康种苗圃直接为大面积生产提供无病种苗。

[1]J.P.马丁，E.V.阿伯特，C.G.休慈（陈庆龙译）.世界甘蔗病害（第1卷）[M].北京：农业出版社，1982：299-319.

[2]Lopes S A and Damann K E.PCR amplification of DNA from bacterial pathogens of sugarcane[J].Phytopathology,1993,83:1398.

[3]James G.A review of ratoon stunting disease[J].International Sugar Journal,1996,98(1174):532-541.

[4]Davis M J,Gillaspie A G,Harris R W,et al.Ratoon stunting disease of sugarcane:isolation of the causal bacterium[J].Science, 1980,210(4476):1365-1367.

[5]游建华，何为中，曾慧，等.谈脱毒健康种苗在广西甘蔗生产的应用及效益展望[J].甘蔗糖业，2001（1）：13-17.

[6]Pan Y B,Grisbam M P,Buroer D M,et al.A polymerase chain reaction protocol for the detection of Clavibacter xyli subsp.xyli, the causal bacterium of sugarcane ratoon stunting disease[J].Plant Disease,1998,82(3):285-290.

[7]李文凤，王晓燕，黄应昆，等.广西宜州蔗区甘蔗宿根矮化病的调查及病原检测[J].中国糖料，2012（1）：47-49.

[8]薛晶，黄应昆，张会华，等.甘蔗温水脱毒健康种苗田间栽培产量比较[J].广西蔗糖，2011（3）：3-6.

Occurrence and Pathogen Detection of Sugarcane Ratoon Stunting Disease in Mile

XUE Jing,HE Wen-zhi,ZHANG Hui-hua,MA Ze-hui,YANG Xiao-li,YU De-hong,DU Ying-chun
(Sugar Industry Office of Yunnan Province Mile City,Mile 652300,China)

Sixty samples were collected to detect RSD by PCR for understanding the occurrence,distribution and damage of sugarcane ratoon stunting disease(RSD)in Mile,Yunnan province.The results showed that 52 samples were positive to RSD as the presence of RSD in Mile.RSD occurrence from different cultivars in different seasons and regions was confirmed by systematic analysis to provide a scientific basis for extension and application of bacteria-free seedlings with hot water treatment for effective control of RSD in Mile.

sugarcane ratoon stunting disease;occurrence;detection

S435.661

A

1007-2624（2014）02-0028-02

10.13570/j.cnki.scc.2014.02.010

2013-08-13

云南省现代农业甘蔗产业技术体系建设专项资金资助。

薛晶（1967-），男，云南省弥勒市人，推广研究员，主要从事甘蔗科技推广，E-mail：mlxjing@sohu.com。