参附注射液对脓毒症大鼠外周血CD3+和γδT细胞的影响

金水芳 江荣林 邢茜 伍万 朱美飞

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.12.012

基金项目：浙江省中医药防治重大疾病攻关计划（2012ZGG001）

作者单位：310006杭州，浙江中医药大学附属第一医院重症医学科

通信作者：江荣林，Email： jiangronglin@126.com

脓毒症（Sepsis）是一种非常凶险的疾病，是各种感染、重度烧创伤、休克及外科大手术后等临床危急重症患者常见的并发症之一，其免疫功能常受到严重抑制，导致继发严重感染。近年研究表明，脓毒症的主要病机为邪毒内陷、或内伤脏气、或亡津失血所致的气机逆乱，正邪交争，阳气未复，阴经耗损，正气虚衰。参附注射液源于中药汤剂参附汤，由人参和附子组成，具有益气扶正，补气通阳，使阳气畅达的功效。参附注射液治疗脓毒症的疗效已被既往研究证实，但其能否消除脓毒症过程中的免疫抑制，尚未见报道。因此本研究通过检测脓毒症大鼠外周血CD3+和γδ T细胞计数的变化，观察参附注射液对细胞免疫功能的影响。

1材料与方法

1.1动物与分组

清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠80只，体质量250～300 g，雌雄各半，由浙江中医药大学实验动物中心提供。所有实验均按照实验动物护理和使用指南进行，且经浙江中医药大学附属第一医院伦理委员会批准。依照人与动物间按体表面积折算的等效剂量比值，折算出中剂量治疗组大鼠的给药量。低中高3个剂量治疗组按1∶2∶4比例分配。大鼠随机（随机数字法）分为假手术组、模型组、参附注射液低剂量治疗组（5 mL/kg）、参附注射液中剂量治疗组（10m L/kg）、参附注射液高剂量治疗组（20 mL/kg），每组16只。

1.2药物、试剂与仪器

参附注射液（红参和附片，辅料聚山梨酯80）购自雅安三九药业有限公司。大鼠外周血淋巴细胞分离液LTS1083购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司;FITC-CD3和PE-TCR γ/δ 大鼠抗体购自美国BioLegend公司。Epics Altra流式细胞仪为美国BECKMAN COULTER公司生产。

1.3模型制备和给药与处置

SD大鼠按照盲肠结扎穿孔法（cecal ligation and puncture， CLP）制备大鼠脓毒症模型。步骤如下：大鼠术前12 h禁食不禁水，选用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射法将大鼠麻醉，固定、备皮、消毒、铺无菌洞巾，在腹部正中做一长约1.5 cm的切口，暴露盲肠，在盲肠中外1/3处结扎，然后在被结扎盲肠的正中位置用16号针对穿2次，挤出少量粪便，还纳盲肠，逐层缝合腹壁切口、皮肤，再次消毒切口周围皮肤，术毕。建模过程中要确保每只大鼠的结扎位置和穿孔位置相似。假手术组开腹后仅翻动十二指肠。实验后大鼠放回笼中喂养，可自由进食和饮水。模型成功标准：发热（肛温超过自身正常对照值1 ℃）、心率加快（增加50%，或约2倍于自身正常对照值）、呼吸频率增加（2倍于自身正常对照值）、白细胞总数变化（正常对照值的2倍或减少50%）等。按照造模成功标准确保动物造模成功，观察期间出现造模不成功或死亡的动物被排除并重新造模补充。

假手术组及模型组大鼠于术后2 h给予生理盐水20 mL/kg腹腔注射，各治疗组在造模成功后2 h分别给予含量为5、10、20 mL/kg的参附注射液（用生理盐水稀释成20mL/kg）腹腔注射。全部大鼠禁食、自由饮水。各组分别于术后12 、24 h随机（随机数字法）处死8只大鼠，收集全血2 mL置于抗凝管，处理后送流式细胞仪检测CD3+、γδ T细胞百分率。

1.4血中CD3+和γδ T细胞检测

将大鼠麻醉后，打开腹腔，分离腹主动脉。取全血2 mL置于抗凝管中混匀，另取干净离心管一支，加入2 mL淋巴细胞分离液，将2 mL全血沿管壁缓慢加入离心管中;采用密度梯度离心法1900 r/min离心25 min;取中间淋巴细胞层，用PBS稀释至10 mL;再用1500 r/min离心10 min，弃上清，加入PBS 0.5 mL重悬;经细胞计数后，取流式试管，加入细胞悬液100 μL，加入抗体，混匀，冰上避光孵育30 min;洗涤后，4 ℃避光1 h内送流式细胞仪检测。

1.5统计学方法

所有结果用均数±标准差（x±s）表示。统计学方法采用SPSS 15.0统计软件包，各组均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），均数间两两比较采用Scheffe法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠基本情况

假手术组大鼠麻醉清醒后，饮水、体温正常，反应灵敏，呼吸均匀平稳，被毛顺滑有光泽，喜扎堆取暖，大便正常。模型组大鼠麻醉清醒后出现活动呆滞、嗜睡、竖毛、呼吸急促、腹胀等现象并逐渐加重，CLP术后12 h内，存活大鼠躯体蜷缩，精神萎靡，基本无活动，不进水，对刺激反应迟钝。12 h后开始有少量活动，呼吸较12 h前平稳，少量饮水，被毛蓬松少光泽，大便稀软。各个治疗组大鼠的活动性、反应性以及饮水状况明显优于模型组。

2.2各组大鼠不同时间点外周血中CD3+细胞

百分率比较

术后12 h，假手术组和低、中、高剂量治疗组术后外周血中CD3+细胞百分率分别为（31.6±6.8）%、（53.3±3.0）%、（54.3±7.0）%、（51.1±3.1）%，均高于模型组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。术后24 h，假手术组和低、中、高剂量治疗组术后外周血中CD3+细胞百分率分别为（55.4±4.2）%、（48.5±4.8）%、（49.0±4.9）%、（49.1±8.6）%，均高于模型组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。低、中、高剂量治疗组外周血中CD3+细胞百分率相同时间点比较差异均无统计学意义，（P>0.05）。见表1。

2.3各组大鼠不同时间点血中γδ T细胞百分率比较

术后12 h，假手术组和低、中、高剂量治疗组术后外周血中γδ T细胞百分率分别为（4.64±0.30）%、（3.31±0.60）%、（3.38±0.19）%、（3.76±0.40）%，均高于模型组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。术后24 h，假手术组和低、中、高剂量治疗组术后外周血中γδ T细胞百分率分别为（4.59±0.22）%、（3.06±0.42）%、（3.28±0.21）%、（3.64±0.31）%，均高于模型组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。低、中、高剂量治疗组外周血中γδ T细胞百分率相同时间点比较差异均无统计学意义，（P>0.05）。见表2。

3讨论

重症脓毒症存在着患病率高、病死率高、治疗费用高的“三高”现象，已经对人类健康构成严重的威胁[1- 2]。现代医学认为，在受到严重感染、外伤打击后，机体可能开始处于一种免疫激活状态，随着病情的发展，则进入免疫抑制状态，促炎和抗炎介质失去平衡而产生一系列连锁反应或瀑布效应，最终将导致多器官功能障碍综合征（MODS），所以消除免疫抑制状态，提高免疫活性是治疗脓毒症的关键。

中医药学上，脓毒症是邪毒内陷、正邪交争，阴经耗损，正气虚衰所致^[3-5]，治疗以补气温阳为主，使阳气畅达。脓毒症患者本有正虚，猝然外邪侵袭，则正气更亏虚，急用人参大补元气，固脱生津。选用附子取其回阳救逆、辛散通行诸经。两药合用，补气温阳，急固欲散之气，补充经脉气血，扶助正气，有助驱邪外出。文献[6-7]研究表明，参附注射液通过抑制炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8 过度表达，以其扶正固本功效应对脓毒症的虚证。以前的研究也证明了参附注射液可通过抑制细胞凋亡和调控细胞炎症因子，减轻和保护组织损伤，降低脓毒症发生^[8-11]。

CD3是全部成熟T细胞的共同分化抗原， 表达于成熟T细胞表面。T细胞是一类重要的免疫活性细胞，在炎症反应中发挥重要作用。γδ T细胞是T淋巴细胞的一个特殊亚群，在正常人外周血T淋巴细胞中一般不超过5%，但在表皮及肠黏膜组织中大量存在（约占40%），在病原菌感染状态时活化和增殖，因此作为机体抵抗外界病原菌的第一道防线。文献[12-14]研究发现γδ T细胞通过调节免疫反应，在机体抗感染免疫、自身免疫疾病以及器官移植免疫耐受的产生和维持中发挥重要作用。在肠道，γδ T细胞通过分泌白细胞介素2、4、6等细胞因子促进黏膜淋巴组织中的B细胞活化、增殖，分泌大量抗原特异的sIgA，增强黏膜免疫，阻止病原菌的进一步入侵，从而有力地调节着机体的免疫应答的类型和强弱，协助αβ T细胞在特异免疫应答中的功能发挥。本研究结果表明，脓毒症模型组大鼠12 h和24 h的外周血中CD3+和γδT细胞百分率与假手术组比较均显著降低（P<0.05），提示脓毒症时其免疫功能受到抑制。而参附注射液可显著提高CD3+和γδ T细胞百分率（P<0.05），提示其可促进机体的细胞免疫反应，从而改善其免疫保护作用。

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（收稿日期：2014-06-01）

（本文编辑：沈惠云）

p1355-1357