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改良愈疡方对溃疡性结肠炎模型小鼠抗炎作用机制的研究

2014-01-19贾慧玲朱叶珊韩玉娜雷淼娜闫宝环

河北医药 2014年14期
关键词:溃疡性阳性细胞结肠炎

贾慧玲 朱叶珊 韩玉娜 雷淼娜 闫宝环

改良愈疡方对溃疡性结肠炎模型小鼠抗炎作用机制的研究

贾慧玲 朱叶珊 韩玉娜 雷淼娜 闫宝环

目的探讨改良愈疡方对右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠抗炎作用机制。方法40只雄性C57BL/6小鼠除正常组外,采用口服DSS造模后,按完全随机法分为模型组、治疗组、对照组,每组10只;正常组和模型组均用0.9%氯化钠溶液灌肠,治疗组动物给与中药灌肠,对照组给与柳氮磺胺吡啶灌肠共14 d。进行结肠肿瘤坏死因子(TNF)-α水平测定及通过免疫组化检测TNF-α在结肠组织中的表达。结果对照组、治疗组治疗前与模型组基本相同,治疗后治疗组的大便较成形、血便及体质量减轻较不明显,一般情况优于模型组及对照组(P<0.05)。SS小鼠结肠炎结肠组织中TNF-α较正常组显著增高(P<0.05),用中药治疗组则显著降低,且优于对照组(P<0.05)。同时,在模型组小鼠结肠组织中,TNF-α表达主要见于黏膜和黏膜下层,主要集中在靠近糜烂或溃疡的周边,小血管扩张的周围,也相对增多,治疗组TNF-α阳性细胞明显减少,与模型组及对照组比较均有显著差异(P<0.05)。结论改良愈疡方对溃疡性结肠炎模型小鼠具有良好的治疗作用,其作用机制是通过降低TNF-α含量,抑制炎症有关。

溃疡性结肠炎;中药灌肠;动物模型;促炎因子

溃疡性结肠炎是病因尚未完全明确的结肠黏膜慢性炎症损伤性肠病,好发于乙状结肠和直肠,其病情反复,病程迁延。目前除外爆发型或病情严重需手术治疗的患者,一般患者多采用内科治疗,该病常用药物为柳氮磺胺吡啶水杨酸制剂(如艾迪莎、美沙拉嗪等)、皮质类固醇激素(如强的松、地塞米松等)和免疫抑制剂,其对溃疡性结肠炎的缓解率约80%,最佳维持缓解方案也仅能使复发率降低50%左右,常因这些药物的不良反应使维持受阻[1]。中药复方改良愈疡方具有解毒消痈,燥湿泄浊的功效,本实验应用更接近人溃疡性结肠炎免疫学特点的右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的模型小鼠,通过改良愈疡方灌肠治疗,以观察其对溃疡性结肠炎模型小鼠的治疗作用并对其作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只雄性C57BL/6小鼠(体重18~22 g;7~12周)(北京维通利华有限公司),合格证号:SCXK(京)2011-0009;DSS(Sigma公司);肿瘤坏死因子(TNF)-α多克隆抗体(Santacrus公司,美国)。

1.2 分组与模型 将小鼠按随机数随机分入正常组、模型组、治疗组和对照组,每组10只;右旋葡聚糖硫酸钠(DSS),分子量 36 000~50 000,10 g DSS粉溶于500 ml自来水中,配成2%浓度,放入4℃冰箱保存。正常组小鼠自由饮用蒸馏水;其余3组自由饮用2%DSS 7 d。

1.3 药物 改良愈疡方为中药复方(白头翁15 g,穿山龙12 g,败酱草12 g,徐长卿9 g,仙鹤草15 g,地榆15 g,槟榔9 g,薏苡仁15 g),原液每毫升含生药3.0 g,由唐山市中医医院制剂室提供。1 ml/d灌肠。柳氮磺胺吡啶(上海三维制药有限公司生产,规格:250 mg/片,批号:200609C15)。将片剂用研钵研细,用100目筛筛过,用蒸馏水配成悬浊液,按0.30 g/kg给药,1 ml/d灌肠。模型组给予0.9%氯化钠溶液灌肠;治疗组给予中药灌肠;对照组给予柳氮磺胺吡啶灌肠;14 d为1个疗程。

1.4 观察指标

1.4.1 观察造模期间动物的一般情况:包括体质量变化分数、大便性状分数、便潜血分数。各组动物从给药到第15天每天记录动物的一般情况,大便性状、用邻联甲苯胺法测便潜血,早晚各1次,并计算大鼠体质量下降百分率。采用夏剑等[2]评分标准并作改进,体质量下降记正分,体质量增加记负分,便潜血按阳性强度分别记0~5分。

1.4.2 检测方法:用2%乌巴比妥钠对小鼠腹腔麻醉(3 ml/kg)后取下整段结肠,于距肛门6 cm处选取0.5 cm长的结肠,纵向切开,用液氮冷冻后切片,厚度为5 μm,用作TNF-α免疫组化,余结肠称重后置入-80℃冰箱保存作ELISA组织测定用,具体实验步骤按试剂盒说明书操作。

1.4.3 结果判断:细胞呈棕黄色为阳性,观察结肠组织各层阳性细胞分布特征,每张切片选取5个最高阳性细胞区域,在高倍镜下(1×400)记数阳性细胞数,求其平均值作为该片阳性细胞均值[3]。

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件,计量资料以±s表示,组间比较采用单因素方差分析,两均数比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况 实验期间,正常组小鼠反应灵活,毛色光润,喜活动,主动觅食,大小便正常;模型组第2天开始精神萎靡,懒于活动,被毛松散无泽,拱背,食量下降,拉稀便或黏液血便,形态消瘦,体重下降,活动进食减少。对照组、治疗组治疗前与模型组基本相同,治疗后治疗组的大便较成形、血便及体重减轻较不明显,一般情况优于模型组及正常组。4组疾病活动指数(DAI)情况见表1。

表1 4组DAI积分比较n=10,±s

表1 4组DAI积分比较n=10,±s

注:与正常组比较,*P <0.01;与对照组比较,#P <0.05

DAI治疗组 1.23 ±0.15*#组别0.32 ±0.13对照组 1.16 ±0.29*模型组 3.07 ±0.41正常组

2.2 光镜下大鼠结肠黏膜组织形态 正常组大鼠结肠各层结构清晰,黏膜上皮细胞排列整齐;肠腺规则,杯状细胞丰富,间质未见充血水肿,固有层可见毛细血管。模型组可见黏膜层大片缺失,黏膜下层有大量炎性细胞浸润,同时可见水肿、坏死的黏膜脱落而形成的溃疡灶,并可见水肿、出血和急性血管炎,血管壁呈纤维素样坏死。治疗组为间质充血水肿不明显,散见少量炎性细胞。其基本形态与正常组相似。黏膜上皮及腺管排列整齐,杯状细胞丰富。对照组为溃疡较浅表,溃疡旁上皮修复明显,腺体增生活跃;隐窝、肠腺及间质可见炎细胞浸润。见图1~4。

图1 正常组结肠黏膜组织形态(SP×200)

图2 模型组结肠黏膜组织形态(SP×200)

图3 对照组结肠黏膜组织形态(SP×200)

图4 治疗组结肠黏膜组织形态(SP×200)

2.3 结肠组织TNF-α水平测定的结果 DSS小鼠结肠炎结肠组织中TNF-α较正常组显著增高,用治疗组则显著降低,且优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。同时,在模型组小鼠结肠组织中,TNF-α表达主要见于黏膜和黏膜下层,主要集中在靠近糜烂或溃疡的周边,小血管扩张的周围,也相对增多,治疗组TNF-α阳性细胞明显减少,与模型组及对照组比较差异有统计学意义(P <0.05)。见表2。

表2 结肠组织TNF-α水平比较及表达n=10,±s

表2 结肠组织TNF-α水平比较及表达n=10,±s

注:与正常组比较,*P <0.01;与对照组比较,#P <0.05

阳性细胞数治疗组 9.80 ±2.43*# 22.18 ±9.01*#组别 TNF-α(pg/mg 蛋白) TNF-α 6.31 ±2.72 18.37 ±13.82对照组 12.48 ±0.21 33.36 ±15.46模型组 14.62 ±3.96* 38.24 ±10.47*正常组

3 讨论

TNF-α又称恶液素或分化诱导因子(DIF),是由单核巨噬细胞产生的一种肽类物质,主要表达在巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的胞浆中,可使中性粒细胞聚集,产生脱颗粒,对淋巴细胞有刺激作用,可上调趋化因子白细胞介素-8(IL-8)的表达[4]。肿瘤坏死因子不但对人或动物多种肿瘤细胞有细胞毒性作用,而且还对机体炎症与免疫反应起到重要的调节作用。本实验表明,通过改良愈疡汤为中药复方治疗的DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠,大便较成形、血便及体质量减轻较不明显,表明该方法对溃疡性结肠炎模型小鼠具有很好的治疗作用。本实验还表明:溃疡性结肠炎模型小鼠结肠组织中TNF-α较正常组显著增高,用改良愈疡汤治疗后则显著降低,说明改良愈疡汤通过对TNF-α的抑制作用,减轻促炎细胞对结肠的损害,从而起到抗炎作用。同时,通过实验表明通过应用改良愈疡汤治疗的DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠肠组织中,TNF-α阳性表达数明显减少,可见抑制TNF-α可以减少其对黏膜的损伤。

溃疡性结肠炎属于中医“泄泻”、“痢疾”、“肠癖”等范畴。中医学在溃疡性结肠炎的研究方面,已形成了独特的理论体系,已经非常规范并取得了重大突破,受到了国内外的重视和国人的青睐。本方中白头翁、败酱草为治痢名药,具有清热解毒,凉血止痢的功效,尚能宣通胃肠郁火,时热毒能散能清,善于清肠湿热及血分热毒,合为君药,现代药理研究发现白头翁具有抗病原微生物,缓解胃肠平滑肌肌痉挛,止血收敛等作用;仙鹤草、地榆凉血止血,穿山龙、徐长卿祛风化湿,解痉止痛作用,共为臣药,现代药理研究显示,穿山龙、徐长卿可以抗炎止痛,调节免疫,具有类激素作用[5,6];薏苡仁补脾除湿,同时也防止苦寒之品克伐脾胃,为佐药,其所含薏苡仁油对细胞免疫、体液免疫有促进作用,同时具有抗炎作用;槟榔苦泄辛散,善行气止痛、实肠止泻,取行气则后重自除之意,为使药[7-9]。

综上所述,改良愈疡方对溃疡性结肠炎模型小鼠具有良好的治疗作用,本方配伍规整,用药简洁,既符合传统中医理论对于溃疡性结肠炎大便脓血症状的病因病机的理解和治疗方法,也通过动物模型实验显示其作用机理与TNF-α具有抑制作用,为临床应用提供了理论依据。此外,中药保留灌肠可使药物直达病所,直接作用于病变部位,是治疗溃疡性结肠炎较好的方法。

1 欧阳钦.炎症性肠病发病机制与治疗研究的最新进展.中华消化杂志,2003,23:453-454.

2 夏剑,邓长生,张明,等.姜黄素对溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜内NF-κB及TNF-α表达的影响.世界华人消化杂志,2005,13:255-257.

3 张文远,韩盛玺,杨红.白头翁醇提物对葡聚糖硫酸钠诱导大鼠结肠炎的抗炎作用机制研究.中华消化杂志,2003,9:568-569.

4 Melgar S,Yeung MM,Bas A,et al.Over-expression of interleukin 10 in mucosal T cells of patients with active ulcerative colitis.Clin EXP Immunsol,2003,134:127-137.

5 仇华泉,苏酩,田景振.中药穿山龙治疗风湿病的研究进展.山东医药,2011,51:115-116.

6 赵丽萍.徐长卿研究进展.中国药业,2011,20:79-80.

7 任毅,张振忠,赵洪波,等.溃疡性结肠炎灌肠液治疗溃疡性结肠炎的临床疗效观察.世界中医药,2013,8:1430-1432.

8 陈武.中药灌肠治疗慢性溃疡性结肠炎30例疗效观察.浙江中医药大学学报,2010,34:356-357.

9 姚文俊,魏靖杰,王琼,等.自拟中药保留灌肠治疗溃疡性结肠炎86例.中国肛肠病杂志,2013,33:34.

Study on the mechanism of anti-inflammatory effect of improved Yuyangfang on mouse model with ulcerative colitis induced by dextran sulfate sodium

JIA Huiling*,ZHU Yeshan,HAN Yuna,et al.*Department of Anus- Intestine Diseases,TCM Hospital of Leting County,Hebei,Laoting 063600,China

ObjectiveTo investigate the mechanism of anti-inflammatory effect of improved Yuyangfang on mouse model with ulcerative colitis(UC)induced by dextran sulfate sodium(DSS).MethodsForty male C57BL/6 mice were randomly divided into four groups:normal control group,model group,treatment group,control group,with 10 mice in each group.Except for normal control group,the mice in control group,model group and treatment group were given orally 4%DSS to establish animal models with ulcerative colitis.After the models were successfully established,the mice in control group and model group were treated with saline enema,however,the mice in treatment group were treated with Chinese medicine enema,in addition,the mice in control group were treated with salazosulfapyridine enema for 14 days.The expression level TNF-α in colon tissue were detected by immunohistochemisty.ResultsAfter treatment the treatment group was superior to control group and model group in the aspects of stools forming,bloody stool,body weight lightening and general condition(P <0.05).The expression level TNF-α in colon tissue of model mice with UC were significantly higher than those in normal control group(P<0.05),however,which were obviously decreased in treatment group,moreover,treatment group was superior to control group(P <0.05).At the same time,the expression of TNF-α in mouse’s colon tissue of model group was mainly found in mucosa and submucosa tissue,mainly concentrated on the tissues of erosion,ulcer and small blood vessels dilatation,TNF-α positive cells in treatment group were significantly decreased,as compared with those in model group and control group(P <0.05).ConclusionThe improved Yuyangfang is effective in treating ulcerative colitis in model mice,and its action mechanism may be related to reducing TNF-α levels and inhibiting inflammation reaction.

ulcerative colitis;Chinese medicine enema;animal model;proinflammatory factor

R 574.62

A

1002-7386(2014)14-2088-03

10.3969/j.issn.1002 -7386.2014.14.002

项目来源:唐山市科技局指令性计划(编号:121302110b)

063600 河北省乐亭县中医院肛肠科(贾慧玲);河北省唐山市中医医院(朱叶珊、韩玉娜、雷淼娜);河北省胸科医院(闫宝环)

2013-12-22)

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