月桂酰氯修饰羊血超氧化物歧化酶工艺优化及酶学性质

杨学山，王本启，王正娟，杨佐青，李远玲，康延良

（甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070）

月桂酰氯修饰羊血超氧化物歧化酶工艺优化及酶学性质

杨学山，王本启，王正娟，杨佐青，李远玲，康延良

（甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070）

以羊血为材料获得超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶液，采用月桂酰氯修饰SOD，在修饰温度、修饰时间、月桂酰氯添加量和丙酮添加量的单因素试验基础上，通过正交试验优化工艺参数，并比较修饰酶与天然酶的酶学性质。结果表明：10 mL酶比活力为4 348.6 U/mg的SOD样液在修饰温度60 ℃、修饰时间30 min、月桂酰氯用量0.1 mL、丙酮添加量为酶液体积的1.5倍条件下充分反应，所得修饰酶活力最强；修饰酶热稳定性、pH值耐受性、半衰期等均优于天然酶。月桂酰氯可用于修饰性能较优的羊血超氧化物歧化酶。

羊血SOD；月桂酰氯；修饰；酶活力

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是需氧生物体内唯一的超氧阴离子自由基清除剂，在抗炎、抗衰老及防辐射等方面有广泛的用途[1-2]。迄今为止人们已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内分离到SOD，不同生物体内SOD含量和活性各不相同，其中以哺乳动物血液中含量和活性最高[3]。甘肃省是是全国五大牧区之一，具有丰富的羊血资源，可作为开发SOD的绝佳原料[4]。SOD可广泛应用于食品、美容、保健和医药等行业[5-6]，但在实际应用过程中，存在体外稳定性差、半衰期短、口服时易受胃蛋白酶分解等缺点[7-9]，限制了SOD相关产品的工业化生产。

化学修饰是提高酶分子稳定性的有效方法之一，脂肪酸[10]、低分子肝素[11]、右旋糖酐[12]、牛血清白蛋白[13]、聚乙二醇[14]等修饰剂都曾用于猪血、牛血来源SOD的化学修饰，取得了较为满意的结果，但对羊血SOD的化学修饰，国内外尚未见报道。月桂酰氯是月桂酸的活化分子，在弱碱性条件下可与SOD分子表面非活性部位的赖氨酸残基共价结合，形成酰化SOD[15]。酰化所产生的空间障碍和静电斥力阻碍了蛋白水解酶和其他抑制剂对SOD活性部位的攻击，使SOD稳定性提高[16]。本研究拟利用新鲜羊血，采用月桂酰氯对分离纯化的天然SOD进行修饰，并对其酶学性质进行研究，以期建立较为高效的修饰方法，为促进羊血SOD深度开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜羊血采自兰州小西湖屠宰场。

牛血清白蛋白 美国Pharmacia公司；月桂酰氯（纯度度≥98%，分子质量218.77 D） 上海诺泰化工有限公司；TritonX-100、CuSO4、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、EDTA、邻苯三酚、丙酮、氯仿、乙醇、柠檬酸钠等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SL-1001电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；TGL-166台式离心机 上海安亭科学仪器厂；HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；PHS-3C pH计 上海雷磁有限公司；TU1800型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 羊血SOD提取工艺流程

以本实验室建立的分离提取工艺进行羊血SOD分离纯化[17]，工艺流程如下：

新鲜羊血→预处理→收集红血球→溶血→去除血红蛋白→丙酮沉淀→磷酸盐缓冲液溶解→热变性处理→透析→DEAE-Sephadex A-50柱层析→真空冷冻干燥→酶比活力测定

其中蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法[18]，SOD活性采用邻苯三酚法测定[19]。酶活力单位（U）定义为：在25 ℃时，1 mL反应液中1 min抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。酶比活力（U/mg）是指每毫克SOD蛋白所具备的酶活力。

1.3.2 SOD化学修饰工艺流程

SOD样液→加月桂酰氯（1 mol/L NaOH维持pH 9.0）→搅拌→丙酮沉淀→抽滤、洗涤→酶比活力测定

1.3.3 单因素试验设计

分别对不同修饰温度、修饰时间、月桂酰氯添加量和丙酮添加量进行单因素试验，重复3次。以修饰酶比活力为指标，为正交试验选择因素水平。

1.3.3.1 修饰温度对修饰SOD比活力的影响

取5组10 mL SOD酶液，各加月桂酰氯0.1 mL，分别置于40、45、50、55、60 ℃条件下，水浴振荡60 min（滴加1 mol/L NaOH维持pH 9.0），再加入1.5倍体积冷丙酮，4 000 r/min离心15 min。计算修饰酶比活力。

1.3.3.2 修饰时间对修饰SOD比活力的影响

取5组10 mL SOD酶液，各加月桂酰氯0.1 mL，55 ℃水浴振荡15、30、45、60、75 min（滴加1 mol/L NaOH维持pH 9.0），再加入1.5倍体积冷丙酮，4 000 r/min离心15 min。计算修饰酶比活力。

1.3.3.3 月桂酰氯添加量对修饰SOD比活力的影响

取5组10 mL SOD酶液，分别加入0.075、0.100、0.125、0.150、0.175 mL月桂酰氯，55 ℃水浴振荡30 min（滴加1 mol/L NaOH维持pH 9.0），再加入1.5倍体积冷丙酮，4 000 r/min离心15 min。计算修饰酶比活力。

1.3.3.4 丙酮添加量对修饰后SOD比活力的影响

取5组10 mL SOD酶液，加入0.1 mL月桂酰氯，55 ℃水浴振荡30 min（滴加1 mol/L NaOH维持pH 9.0），分别加入酶液体积0.75、1.00、1.25、1.50、1.75倍冷丙酮，4 000 r/min离心15 min。计算修饰酶比活力。

1.3.4 正交试验优化

根据单因素试验结果确定因素和水平，采用四因素三水平L9（34）正交试验设计，计算月桂酰氯修饰SOD每一试验组合的酶比活力，重复3次。结果进行直观分析得到最优组合，通过对最优组合条件进行验证实验，确定月桂酰氯修饰SOD的最优工艺。

1.3.5 修饰酶与天然酶稳定性比较

1.3.5.1 温度稳定性

取天然酶和修饰酶各5组，分别在55、65、75、85、95 ℃条件下处理30 min，测定天然酶和修饰酶的相对酶活力（以起始酶活力为100%计）。重复3次。

1.3.5.2 pH值稳定性

分别配制pH值为3、5、7、9、11的Tris-HCl缓冲液，取天然酶和修饰酶各5组，每组加入上述不同pH值溶液，室温静置1 h，测定其相对酶活力(以起始酶活力为100%计)，比较修饰酶和天然酶的pH值稳定性。重复3次。

1.3.5.3 半衰期测定

将同批次制备的天然酶和液态修饰酶贮于4 ℃，每隔4 d测其酶活力变化，重复3次。分别以第1天与第5天、第5天与第9天所得酶活力值代入下式计算半衰期[20]。

式中：t1/2为半衰期/d（即修饰酶活力下降为最初活力一半时所经历的连续工作时间）；E0为原始酶活力/（U/ mL）；t为时间/d；E为t时的酶活力/（U/ mL）。最后将所得t1/2求平均值，计算得修饰酶和天然酶的半衰期。

2 结果与分析

2.1 羊血SOD分离纯化

根据1.3.1节的方法，获得羊血SOD提取液酶活力为861.1 U/ mL，蛋白含量为0.198 mg/mL，经计算酶比活力为4 348.6 U/mg。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 修饰温度对修饰SOD比活力的影响结果

图1 修饰温度对SOD比活力的影响Fig.1 Effect of modification temperature on SOD specific activity

由图1可知，修饰温度为55 ℃时SOD比活力最高，修饰效果最好，且和40、45、50、60 ℃之间在5%水平上差异显著。45、50、60 ℃之间在5%水平上差异不显著性，所以选择55 ℃为SOD修饰的反应温度。SOD属于蛋白质，温度较低时蛋白质残基与修饰剂的耦合不充分，温度较高时修饰剂与氨基酸残基耦合过多均导致酶比活力下降。

2.2.2 修饰时间对修饰SOD比活力的影响结果

图2 修饰时间对SOD比活力的影响Fig.2 Effect of modification time on SOD specific activity

由图2可知，修饰时间在15、60、75 min时差异不显著；修饰时间30 min时所得到的SOD酶比活力最高，且与15、45、60、75 min之间在5%水平上有显著性差异，所以应选择30 min为较佳修饰时间。当温度一定时，较短的修饰时间，月桂酰氯与SOD氨基酸残基耦合不充分，而时间过长可能会导致月桂酰氯与SOD活性中心氨基酸残基耦合导致SOD比活力下降。

2.2.3 月桂酰氯添加量对修饰SOD比活力的影响结果

图3 月桂酰氯添加量对SOD比活力的影响Fig.3 Effect of lauroyl chloride dosage on SOD specific activity

由图3可知，当10 mL酶液中月桂酰氯用量为0.100 mL时，修饰后的SOD酶比活力最高，且和月桂酰氯的用量为0.075、0.125、0.150、0.175 mL之间在5%水平上差异显著，而月桂酰氯的用量为0.075、0.125、0.150、0.175 mL之间在5%水平上差异不显著。月桂酰氯作为SOD的修饰剂，用量过少会造成月桂酰氯与SOD氨基酸残基耦合不充分；用量过多，对SOD活性中心与非活性中心氨基酸残基均发生反应，使SOD比活力下降。

2.2.4 丙酮添加量对修饰后SOD比活力的影响结果

图4 丙酮添加量对SOD比活力的影响Fig.4 Effect of acetone dosage on SOD specific activity

由图4可知，丙酮添加量为酶液体积的1.5倍时所沉淀的SOD修饰酶比活力最高，且和其他水平差异显著。丙酮作为SOD的沉淀剂，体积分数较小时，沉淀不完全，溶液中有游离SOD；体积分数较大时，可将修饰液中其他杂蛋白充分沉淀，导致酶比活力下降。

2.3 正交试验结果与分析

采用L9（34）试验设计优化修饰羊血SOD工艺条件，结果如表1所示。

表1 L9（34）正交试验设计及结果Table 1 Design and results of L9((34) orthogonal array experimenttss

由表1极差值可知，影响月桂酸修饰SOD因素的主次顺序为：A＞B＞C＞D。由K值可以确定月桂酸修饰SOD正交试验的最优组合是A3B2C2D2，即确定的最优工艺参数为修饰温度60 ℃、修饰时间30 min、月桂酰氯用量0.1 mL/10 mL酶液、丙酮添加量为酶液体积的1.5倍。

用SPSS13.0统计软件对试验结果进行方差分析，其结果如表2所示。因素A、B差异显著P＜0.05，因素C、D不显著，表明修饰温度和修饰时间对本试验的影响较大。

表2 正交试验方差分析结果Table 2 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

2.4 验证实验结果

由于最优组合在L9（34）正交试验设计中未出现，需对正交试验得到的最优组合进行验证实验。在修饰温度60 ℃、修饰时间30 min、月桂酰氯添加量0.1 mL/10 mL酶液、丙酮添加量为酶液体积的1.5倍条件下修饰SOD，重复3次。测得SOD修饰酶平均比活力为3 398.3 U/mg，活力保留率为78.1%，比正交试验中其它组合得到的酶比活力都高，可见其为正交试验确定的最佳工艺参数。

2.5 修饰酶与天然酶的稳定性比较

2.5.1 酶的温度稳定性

图5 修饰酶和天然酶对不同温度稳定性的比较Fig.5 Stability of modified and natural SOD at different temperatures

由图5可知，在55 ℃以下时，修饰酶和天然酶的相对酶活力大致相同，随着温度逐渐升高至95 ℃，天然酶的相对酶活力急剧下降，低至10%，而修饰酶的相对活力下降幅度较小，仍在原来酶活力48%以上。

2.5.2 酶的pH值稳定性

图6 修饰酶和天然酶对不同pH值稳定性的比较Fig.6 Stability of modified and natural SOD at different pHs

由图6可知，修饰酶及天然酶的最适pH值均为7.0，随着pH值的升高或减小，两种酶活力都有所下降，但在极端酸碱条件下，修饰酶相对酶活力高达67.1%，而天然酶相对酶活力仅为35.4%。

2.5.3 修饰酶和天然酶半衰期测定

经计算在4 ℃保存条件下，天然酶半衰期为4 d，修饰酶半衰期为141.5 d，比天然酶提高了137.5 d。

与天然SOD酶学性质相比较，由于在修饰SOD过程中，月桂酰氯耦合在了SOD的非活性基团上，在酸碱强度较大、温度较高条件下不易影响SOD酶活性中心，从而使修饰酶活性保持较好的稳定性。

3 结 论

本实验以新鲜羊血中提取的SOD原料，根据不同单因素条件试验结果，对月桂酰氯修饰羊血SOD的主要影响因素进行L9（34）正交试验优化，确定的最优工艺参数为10 mL酶比活力为4 348.6 U/mg的SOD样液、修饰温度60 ℃、修饰时间30 min、月桂酰氯用量0.1 mL、丙酮添加量为酶液体积的1.5倍，在此条件下修饰SOD，所得SOD平均比活力为3 398.3 U/mg。

天然酶与修饰酶理化性质测定结果表明：SOD经月桂酸修饰后热稳定性、pH值耐受性、半衰期等均优于天然酶。月桂酰氯酸修饰SOD扩展了SOD的实用价值，有利于它在食品、日化及药物等方面的实际应用。

[1] BULLOCK J, CHOWDHURY S, SEYERDIA A, et al. Comparison of results of various methods used to determine the extent of modification of methoxy polyethylene glycol5000-modified bovine cupri-zinc superoxide dismutase[J]. Analytical Biochemistry, 2007, 254(2): 254-262.

[2] NAMIR I A, HADDAD Q. Purification of copper-zincsuperoxide dismutase from Semen Lethospermi (SL) by copper-chelate affinity chromatography[J]. China Journal Nature Medicine, 2004, 6(2): 379-384.

[3] 杜秀敏, 殷文璇, 张慧, 等. 超氧化物歧化酶(SOD)的研究进展[J].中国生物工程杂志, 2003, 23(1): 48-50.

[4] 杨学山, 付文力, 孔志亮, 等. 铜盐-热变性法分离提取羊血超氧化物歧化酶工艺条件优化[J]. 食品科学, 2012, 33(20): 42-45.

[5] MATTIAS B, MAKA I, SAMAIL M, et al. Integrated operation of continuous chromatography and transformations for the generichigh yield production of fine chemicals[J]. Journal of Biotechnology, 2006, 25(8): 146-162.

[6] DANIEL A, RUTH E S. Modeling suberization with peroxidasecatalyzed polymerization of hydroxycinnamic acids: cross-coupling and dimerization reactions[J]. Photochemistry, 2006, 17(6): 743-753.

[7] LIN C, LEE T L, DUAN K, et al. Molecular cloning, characterization, and expression of a cDNA coding copper/zinc superoxide dismutase from black porgy[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 48(8): 4-7.

[8] 高巍, 孙庆林. 羊血铜锌超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)的分离纯化[J]. 生物技术, 2010, 20(1): 86-89.

[9] MAIRKOVSKY M, ZIV V, NEVO N. Cu/Zn superoxide dismutase plays important role in immune response[J]. The Journal of Immunology, 2003, 25(6): 2993-3001.

[10] 桂兴芬, 杨萍, 邹国林. 月桂酸修饰超氧化物歧化酶的制备及其稳定性研究[J]. 武汉大学学报: 自然科学版, 2005, 44(4): 498-500.

[11] 齐敬总, 王凤山, 张鸿伟, 等. 低分子肝素修饰超氧化物歧化酶及修饰酶的理化性质研究[J]. 中国药学杂志, 2006, 41(2): 150-153.

[12] 吴云, 袁勤生. 修饰超氧化物歧化酶的制备、性质及代谢[J]. 华东化工学院学报, 1998, 14(6): 664-667.

[13] 刘小云, 叶松柏, 谭紫电. 超氧化物歧化酶的化学修饰[J]. 四川生理科学杂志, 2004, 16(1): 25-33.

[14] 邹国林, 夏璐, 李鹏, 等. 有机溶剂可溶的超氧化物歧化酶制备及其性质[J]. 生物化学与生物物理学报, 1996, 28(1): 83-85.

[15] 李东华, 王鸿, 孙汉栋, 等. 超氧化物歧化酶吸附分离-化学修饰的耦合过程[J]. 化工进展, 2009, 28(1): 135-140.

[16] 周志刚. 超氧化物歧化酶的化学修饰进展[J]. 安徽医药, 2010, 14(6): 623-626.

[17] 杨学山, 杨孝朴, 杨志杰, 等. 离子交换层析法纯化羊血SOD及其稳定性研究[J]. 甘肃农业大学学报, 2010, 45(5): 157-160.

[18] 宋宏新. 现代生物化学实验技术教程[M]. 西安: 陕西人民出版社, 2002: 157-162.

[19] 杨明琰, 张晓琦, 沈俭. 超氧化物歧化酶两种邻苯三酚自氧化测定活力方法的比较[J]. 微生物学杂志, 2006, 26(3): 40-42.

[20] 申煜, 魏建民, 常弘. 牛血Cu/Zn-SOD的热稳定性及动力学研究[J].动物学杂志, 2004, 39(5): 78-80.

Optimized Preparation and Enzymatic Characterization of Lauroyl Chloride Modified SOD from Sheep Blood

YANG Xue-shan, WANG Ben-qi, WANG Zheng-juan, YANG Zuo-qing, LI Yuan-ling, KANG Yan-liang
(College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The process condition for modifying SOD from sheep blood by lauroyl chloride was explored. Four experimental parameters including reaction temperature, reaction time and the amounts of lauroyl chloride and acetone added to SOD solution were investigated by one-factor-at-a-time experiments and optimized by orthogonal array design. The highest enzyme activity was observed for SOD with a specific activity of 4 348.6 U/mg in a 10 mL aqueous solution when modified by reaction with 0.1 mL of lauroyl chloride and 15 mL of acetone for 30 minutes at 60 ℃. The modified SOD exhibited improved heat stability, pH tolerance and half-life compared to the intact one. Therefore, lauroyl chloride can be used to modify sheep blood SOD for better enzymatic performance.

sheep blood SOD; lauroyl chloride; modification; enzyme activity

TS251.9

A

1002-6630（2014）07-0128-04

10.7506/spkx1002-6630-201407026

2013-04-12

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（GNSW-2010-03）；甘肃农业大学大学生科研训练计划重点项目（20120803）

杨学山（1977—），男，副教授，硕士，主要从事生物化学与生物制品开发研究。E-mail：yangxs@gsau.edu.cn