不同干燥方式对银耳多糖理化特性及抗氧化活性的影响

吴 振，李 红，罗 杨，谭红军,,*，陈 岗，师 萱，杨 勇，詹 永，石文娟，黄婧禹

（1.重庆市中药研究院，重庆 400065；2.重庆市食品药品检验所，重庆 401121；3.重庆市银耳营养食品企业工程技术研究中心，重庆 409003）

不同干燥方式对银耳多糖理化特性及抗氧化活性的影响

吴 振1，李 红2，罗 杨1，谭红军1,3,*，陈 岗1，师 萱1，杨 勇1，詹 永1，石文娟3，黄婧禹1

（1.重庆市中药研究院，重庆 400065；2.重庆市食品药品检验所，重庆 401121；3.重庆市银耳营养食品企业工程技术研究中心，重庆 409003）

研究传统热风干燥、冷冻干燥和抽真空干燥等不同干燥方式对银耳多糖（Tremella fuciformis polysaccharides，TFPs）的理化特性和体外还原力、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羟自由基（hydroxyl free radical，•OH）和超氧阴离子自由基（superoxide free radicals，O2－·）的影响。结果表明：3种干燥方式对TFPs均有显著影响，其中冷冻干燥处理多糖（freezing drying Tremella fuciformis polysaccharides，TFPs-F）的得率、总糖和黏度最高；3种干燥方式对粗多糖相对分子质量分布和和抗氧化活性有一定影响；TFPs-F的还原力、清除DPPH自由基、•OH和O2－·的半抑制浓度（half-inhibitory concentration，IC50）分别为2.61、1.64、1.78、1.75 mg/mL；传统热风干燥和抽真空干燥处理多糖的还原力、清除DPPH自由基、•OH和O2－·的IC50高于低温冷冻干燥处理多糖相应的IC50。结果说明，冷冻干燥处理是获得高品质和高活性银耳多糖的较好方法。

银耳多糖；干燥方式；理化特性；抗氧化活性

银耳（Tremella fuciformis）在分类学上属于银耳科（Tremellaeeae），银耳属（Tremella），是一种重要的食用菌，其含有多糖、酚类、黄酮类和多种氨基酸等生物活性成分，被誉为“食用菌之王”[1]，是一种优质的功效成分提取资源。中医认为，银耳味甘淡性平，归肺、胃经，具有滋阴润肺、养胃生津的功效。银耳的药理活性多数与银耳多糖（Tremella fuciformis polysaccharides，TFPs）有关，TFPs是银耳孢子经深层发酵的产物，主要是以α-（1,3）-D-甘露糖为主链的杂多糖，具有广泛的药理活性。近年来，国内外研究发现，银耳多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化衰老、降血糖血脂、抗凝血血栓、抗溃疡、促进蛋白质合成、抗病毒、促进神经细胞生长及改善记忆力等多方面的活性[2-7]，已成为当前医药和保健食品领域研究与开发的热点。

国内外研究发现，真菌多糖的生物功能与其理化组成、水溶性、分子质量大小、分支度、黏度和高级螺旋结构等紧密相关，主要受到样品处理方法、提取工艺参数和干燥方法三大类因素的影响[8-11]。Ma Lishuai等[11]研究了不同干燥条件对白桦茸多糖理化特性和生物活性的影响，Fan Liuping等[12]通过分析不同干燥处理方法对灵芝多糖抗氧化活性的影响，结果均发现，不同干燥方式对真菌多糖的理化特性和生物活性有显著的影响。脱水干制是真菌多糖加工贮藏的一个重要方法，传统热风干燥已经广泛应用于食品企业，但是传统高温干燥破坏了多糖的品质和活性[12]。因此，本实验研究了3 种不同多糖干燥方式（传统热风干燥、冷冻干燥和抽真空干燥）对TFPs的得率、理化特性和抗氧化活性的影响，该研究对于引导银耳多糖的科学利用和发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜银耳：采于重庆市黔江区，子实体呈乳白色，胶质半透明，直径10～12 cm，鲜样平均含水率为75%～80%（湿基），采后在冷藏并保湿的条件下贮运。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美国Sigma-Aldrich公司；Dextrans系列标样（T-10、T-40、T-70、T-500）、Sephadex G-150 瑞典 Pharmacia公司；其他化学试剂均为国产分析纯；所用水为双蒸水，所用溶液均自行配制。

1.2 仪器与设备

DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱、DK-8D三孔电热恒温水槽 上海齐欣科学仪器有限公司；UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；LSC真空冷冻干燥机德国Martin Christ公司；NDJ-1型旋转式黏度计 上海菁海仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 银耳多糖提取

将银耳干燥（55 ℃）至水分含量8%；粉碎机粉碎，过60 目筛。用95%的乙醇40 ℃热处理两次（2×1 h），以除去单糖、低聚糖和色素等小分子物质，同时灭酶活以防止在提取过程中多糖的降解。抽滤、浓缩、干燥，得到预处理原料。预处理后的银耳粉于95℃热水提取两次（料液比为30∶1，2×2 h）→离心（3 000 r/min，10 min）→合并上清液→95%乙醇、100%乙醇和丙酮分别处理，4 ℃放置24 h→离心（3 000 r/min，10 min）→溶解，Sevag方法脱蛋白[13]（10 次）→透析→粗提物；将粗提物分别采用传统热风干燥（50 ℃，16 h）、冷冻干燥（－50 ℃，72 h）和抽真空干燥（50 ℃，0.06 MPa，12 h）等不同干燥方式进行处理，干燥至水分含量小于10%；传统热风干燥、冷冻干燥和抽真空干燥获得的多糖分别命名为传统热风干燥多糖（traditional hot-air drying Tremella fuciformis polysaccharides，TFPs-H）、冷冻干燥多糖（freezing drying Tremella fuciformis polysaccharides，TFPs-F）和抽真空干燥多糖（vacuuming drying Tremella fuciformis polysaccharides，TFPs-V）。

1.3.2 粗多糖化学组成分析

以葡萄糖为标样，采用苯酚-硫酸法测定总糖含量，具体参考文献[14]；灰分测定参考AOAC 942.05方法[15]，蛋白质含量测定参考AOCS Ba 4a-38方法[16]；采用NDJ-1型旋转式黏度计测定粗多糖的相对黏度，粗多糖水溶液质量浓度为10 mg/mL（25 ℃）[17]。各组分以占干质量的百分比计算。

1.3.3 粗多糖相对分子质量

采用凝胶过滤色谱法测定TFPs相对分子质量。分别将已知相对分子质量的DextranT-10、DextranT-40、DextranT-70、DextranT-500（相对分子质量分别为1×104、4×104、7×104、5×105）溶解于蒸馏水中，质量浓度为2 mg/mL。上Sephadex G-150凝胶柱（1.6 cm× 100 cm），以纯水洗脱，上样量1 mL，流速24 mL/h，自动部分收集仪收集洗出液，用苯酚-硫酸法于490 nm检测葡聚糖，根据洗脱体积求得相对分子质量标准曲线。以相同的条件将样品上柱，根据洗脱体积，求得相对分子质量[18]。

1.3.4 体外抗氧化活性的测定

1.3.4.1 还原力的测定

参照Wu Huichun等[19]的方法，在具塞比色管中加入0.2 mol/L、pH值为6.6的磷酸缓冲液2 mL、不同质量浓度的样品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）0.2 mL和质量分数为1%的铁氰化钾溶液2 mL，50 ℃水浴反应20 min后迅速冷却，加入质量分数为10%的三氯乙酸溶液2mL，将混合物3 000 r/min离心20 min，取上清液2 mL，加入2 mL蒸馏水和质量分数为0.1%的三氯化铁0.4 mL，混匀后室温放置10 min，于波长700 nm波长处测定吸光度（吸光度越大表明还原力越强）。VC作为阳性对照；还原力的半抑制浓度（halfinhibitory concentration，IC50）为吸光度0.50时对应的测试物的质量浓度。

1.3.4.2 清除DPPH自由基的测定

参照Liu Lixiang等[20]方法进行，将DPPH 1 mL（10–4mol/L，95%乙醇）与不同质量浓度（0.5～3.5 mg/mL）的样品和VC阳性对照溶液3 mL混匀后于波长517 nm处测定吸光度Ai，同时，将DPPH 1 mL与样品空白3 mL混匀后测定吸光度Ac，将不同质量浓度的样品溶液3 mL与95%乙醇1 mL混匀后测定吸光度Aj，按式（2）计算DPPH自由基清除率。

以样品质量浓度对DPPH自由基清除率作图，求出清除率为50%时所需样品质量浓度，即半抑制浓度（IC50）。

1.3.4.3 清除羟自由基（hydroxyl free radical，•OH）的测定

参照Wang Hongyuan等[21]方法并略有修改。取0.6 mL邻二氮菲的乙醇溶液（5 mmol/L），加入0.4 mL的磷酸盐缓冲液（0.15 mol/L，pH 7.40）和0.6 mL的FeSO4（0.75 mmol/L），加入待测样品2 mL混匀后，加入0.4 mL的H2O2（0.1%）摇匀，37℃条件下水浴60 min，在536 nm波长处测其吸光度（Ai）；以去离子水代替TFPs和H2O2溶液重复上述操作，在536 nm波长处测其吸光度（Ac）；以去离子水代替TFPs来重复以上操作，在536 nm波长处测得吸光度（Aj）。按式（3）计算·OH清除率。

以样品质量浓度对·OH清除率作图，求出清除率为50%时所需样品质量浓度，即IC50。

1.3.4.4 清除超氧阴离子自由基（superoxide free radical，O2－·）的测定

参照Jiang Bo等[22]的方法，在具塞比色管中加入不同浓度的样品和VC阳性对照溶液（0.5～3.5 mg/mL）4 mL、0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH8.2）2.5 mL混匀，在25℃水浴后加入6.0 mmol/L的邻苯三酚溶液（25 ℃水浴预热）2.5 mL，用0.5 mL的浓盐酸终止反应，迅速在299 nm波长处测定吸光度A1，以去离子水代替邻苯三酚溶液测定吸光度A2，以去离子水代替样品溶液测定吸光度A0，按式（4）计算O2－·清除率。

以样品质量浓度对O2－·清除率作图，求出清除率为50%时所需样品质量浓度，即IC50。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 15数据处理软件，各组数据结果均以±s（n=3）表示，并进行方差分析，LSD法多重比较，P＜0.05为差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 不同干燥方式对TFPs理化特性的影响

表1 不同干燥方式对银耳多糖化学组成和相对黏度的影响Table 1 Effects of different drying methods on chemical composition and viscosity of TFPs

由表1可知，冷冻干燥处理的TFPs得率最高，达到（19.17±1.13）%，但不同干燥方式对TFPs得率的影响差异不显著（P＞0.05）；不同干燥方式对TFPs总糖有显著影响（P＜0.05），其中冷冻干燥处理的TFP s总糖最高，达到（78.58±3.11）%。冷冻干燥TFPs的相对黏度最大（2.82±0.11），与传统热风干燥和抽真空干燥处理差异显著（P＜0.05）。传统热风干燥和抽真空干燥处理所需温度更高，较高温度情况下，多糖可能发生降解。Ma Lishuai等[11]研究了不同干燥条件对白桦茸多糖理化特性和生物活性的影响，结果发现不同干燥方式对白桦茸多糖化学组成有显著的影响，提取效果为：冷冻干燥＞抽真空干燥＞传统热风干燥。Nep等[10]通过分析不同干燥处理方法对Grewia mollis多糖理化特性的影响，结果发现不同干燥方式对真菌多糖的理化特性有显著的影响。

2.2 不同干燥方式对TFPs相对分子质量分布的影响

由图1、表2可知，冷冻干燥TFPs凝胶柱洗脱曲线主要有4 个洗脱峰，且相对分子质量分布范围较窄，分别为33.27×104、12.30×104、6.34×104和1.17×104；传统热风干燥TFPs凝胶柱洗脱曲线主要有4 个洗脱峰（相对分子质量分别为54.70×104、14.52×104、4.55×104和2.27×104）；而抽真空干燥TFPs凝胶柱洗脱曲线的4 个洗脱峰介于TFPs-H和TFPs-F之间，其中TFPs-H的相对分子质量最大，可能原因在于高温作用下多糖分子更易发生交联和聚集[11]。根据Sun Liqin等[23]报道，通过制备不同相对分子质量的紫球藻多糖（分子质量位于6.55～2 918.7 kD），结果发现分子质量2 918.7 kD的紫球藻多糖没有明显的抗氧化活性，降解之后的低分子质量多糖显示出较强的抗氧化保护作用，并且分子质量6.55 kD多糖的抗氧化活性强于分子质量60.66 kD和256 kD多糖。

图1 不同干燥方式对TFPs相对分子质量分布的影响Fig.1 Effects of different drying methods on molecular size distribution of TFPs

表2 不同干燥方式对银耳多糖相对分子质量的影响Table 2 Molecular weight of TFPs dried by different metho ds

2.3 不同干燥方式对TFPs还原力和清除自由基活性的影响

图2 不同干燥方式对TFPs的还原力（A）和清除DPPH自由基（B）、・OH（CC）、OO2－·（DD）的影响Fig.2 Effects of different drying methods on reducing power (A), DPPH free radical (B), ・OH (C) and O－2· (D) scavenging activity of TFPs

由图2A可知，在实验质量浓度范围内（0.5～3.5 mg/mL），还原力与质量浓度呈线性关系，线性方程R2均大于0.99；TFPs-H、TFPs-F、TFPs-V与VC还原力的IC50值分别为3.48、2.61、3.23、1.66 mg/mL，表明TFPs具有一定的还原能力，但还原能力弱于VC，其中还原力能力为：VC＞TFPs-F＞TFPs-V＞TFPs-H。由图2B可知，TFPs对DPPH自由基的清除率随着TFPs质量浓度的增加而逐渐增大，两者呈正相关；VC、TFPs-F、TFPs-V、TFPs-H对DPPH自由基的IC50值分别为0.98、1.64、2.11、2.19 mg/mL，其中TFPs-V、TFPs-H对DPPH自由基清除作用差别较小。由图2C可知，3 种干燥处理的银耳多糖TFPs对•OH的清除率，随TFPs质量浓度的增加而增大，相同质量浓度条件下，•OH的清除能力为：VC＞TFPs-F＞TFPs-V＞TFPs-H，其中TFPs-V和TFPs-F对•OH清除作用较强。由图2D可知，与TFPs清除DPPH自由基和•OH能力相比，TFPs清除O2－·能力较弱（清除率≤80.56%），总体趋势与TFPs对•OH的清除率相似。

3 结 论

银耳是人们生活中常用的食用菌，含有酚类、黄酮类及膳食纤维等物质，但多糖是其主要的活性成分，开发银耳多糖新产品具有良好的经济和社会效益。为提高银耳多糖的品质，本实验采用传统热风干燥、冷冻干燥和抽真空干燥3 种方式干燥银耳多糖，通过测定TFPs的化学组成、相对分子质量分布和抗氧化活性，比较了3 种干燥方法的优劣。结果表明：3 种干燥方法对TFPs化学组成和抗氧化活性有显著影响（P＜0.05），其中冷冻干燥处理较有优势，TFPs-F品质和抗氧化活性最高，优于其他两种干燥方法，较适于工业生产较高品质和高活性的抗氧化银耳多糖。

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Effects of Different Drying Methods on Physio-chemical Properties and Antioxidant Activities of Polysaccharides Extracted from Tremella fuciformis

WU Zhen1, LI Hong2, LUO Yang1, TAN Hong-jun1,3,*, CHEN Gang1, SHI Xuan1, YANG Yong1, ZHAN Yong1, SHI Wen-juan3, HUANG Jing-yu1
(1. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China; 2. Chongqing Institute for Food and Drug Control, Chongqing 401121, China; 3. Chongqing Engineering Research Center for Tremella Nutrition Food Enterprises, Chongqing 409003, China)

The influences of different drying methods, including traditional hot air drying, freeze drying and vacuum drying, on the physio-chemical properties and antioxidant activities of crude polysaccharides extracted from Tremella fuciformis (TFPs) were investigated. The results showed that freeze-dried TFPs (TFPs-F) had higher extraction efficiency, total sugar content and viscosity. It was also found that molecular size distribution and antioxidant activities of TFPs were affected by three different drying methods. The IC50for reducing power and scavenging activities against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH free radical), hydroxyl and superoxide anion radicals of TFPs-F were 2.61, 1.64, 1.78, and 1.75 mg/mL, respectively. Moreover, it was clearly demonstrated that the IC50of traditional hot air dried and vacuum dried TFPs was higher than that of low temperature freeze dried TFPs. The data obtained in vitro models suggest that freeze drying is an appropriate and effective way of obtaining the polysaccharides with antioxidant activity from Tremella fuciformis.

Tremella fuciformis polysaccharides; drying methods; physio-chemical properties; antioxidant activity

TS201.2

A

1002-6630（2014）13-0093-05

10.7506/spkx1002-6630-201413017

2013-09-18

重庆市科技攻关计划项目（CSTC2012AA5026；CSTC2012GG-YYJS0188；CSTC2013YYKFA80004）；重庆市卫生局中医药科研课题（ZY20132075）

吴振（1985—），男，助理研究员，硕士，主要从事天然产物研究与开发。E-mail：wuzhen985@126.com

*通信作者：谭红军（1973—），男，副研究员，硕士，主要从事中药健康食品研发。E-mail：thj-1973@163.com