南极磷虾肉糜冷藏过程中蛋白水解酶的稳定性及自溶特性

丁浩宸，李栋芳，张燕平*，许 刚，徐舒展，黄天翔

（浙江工商大学 水产品加工研究所，浙江 杭州 310035）

南极磷虾肉糜冷藏过程中蛋白水解酶的稳定性及自溶特性

丁浩宸，李栋芳，张燕平*，许 刚，徐舒展，黄天翔

（浙江工商大学 水产品加工研究所，浙江 杭州 310035）

以总蛋白酶活力为指标，研究3种自制南极磷虾肉糜（虾肉糜）5 ℃冷藏过程中蛋白水解酶的稳定性，并以蛋白质组分、汁液流失率为指标，结合感官评价，研究其自溶特性。结果表明：在冷藏过程中，虾肉糜所含的消化腺蛋白酶稳定性较高，未充分漂洗的虾肉糜受到持续的水解；虾肉糜的自溶特性主要表现为盐溶性蛋白、碱溶性蛋白的降解和水溶性蛋白的增加，且汁液流失率增大和感官品质劣化。未漂洗虾肉糜的自溶现象尤为显著，不宜冷藏保存，而2次漂洗虾肉糜在冷藏过程中自溶特性不显著，虽然存在一定的蛋白质组分变化和汁液流失率增加现象，但感官品质未大幅下降，因而适宜于短时间内在5 ℃进行冷藏保存。

南极磷虾肉糜；冷藏；蛋白水解酶；自溶特性

南极磷虾（Euphausia superba）是一类生物量巨大的海洋甲壳类动物，预估其生物量在4～15亿t，被认为是地球上最大的动物蛋白库[1-2]。作为一种具有独特蛋白酶系统和自溶特性的水产食品资源，南极磷虾的生化特性已受到了多方关注和研究[3-7]。南极磷虾死亡后，虾体中的蛋白水解酶立即被激活并引发虾体的快速自溶，自溶作用则促进虾体品质劣化，这被认为是南极磷虾完全商业化加工和新型磷虾食品开发的主要障碍[8-10]。

2010年以来，中国成功进行了数次南极磷虾探捕并开始统筹发展磷虾产业，对于磷虾肌肉蛋白质的利用是目前基础研究和产品研发的重要方向之一[11]。经采肉、漂洗、脱水和速冻获得的南极磷虾肉糜是南极磷虾初级加工的重要分支产品[11]，以其为中间原料可以用于制备、生产南极磷虾风味的水产食品和营养基料。

李学英等[12]以pH值、出肉率和可溶蛋白含量为指标对南极磷虾0～3 ℃冷藏过程中的品质变化进行了研究；迟海等[13]对南极磷虾0、5 ℃条件下微生物、挥发性盐基氮和三甲胺氮指标的变化趋势进行了研究。但国内外针对南极磷虾肉糜的研究报道较少。而南极磷虾肉糜的部分加工利用环节和流通零售渠道都处于冷藏温度环境。因此，探讨冷藏条件下南极磷虾肉糜酶学特性和自溶特性的变化对其实际加工利用有一定的理论指导意义。本实验自制3种不同的南极磷虾肉糜，研究其在5 ℃冷藏过程中总蛋白酶活力的变化，并以蛋白质组分、汁液流失率和感官品质为指标研究其自溶特性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极磷虾整虾冻块 辽宁省大连海洋渔业集团公司，南极磷虾为2012年2月从南极海域捕获并低温冻藏，当年10月运抵实验室进行实验。

所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

滚筒采肉机 广东鼎成机械有限公司；液媒速冻机大连比泽安航制冷设备有限公司；DW-40L92医用低温保存箱、BCD-251WBSV冰箱 海尔集团；T18 basic均质机 德国IKA公司；RC 6 PLUS冷冻离心机 美国Thermo公司；UV-2100紫外-可见分光光度计 美国Unico公司；K-435消化炉、B-324凯氏定氮仪 瑞士Büchi公司；Free Zone 2.5真空冷冻干燥机 美国Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 南极磷虾肉糜的制备

南极磷虾整虾冻块切割成小块（5 cm×5 cm×5 cm），于10 ℃环境下半解冻至磷虾个体易于分离。采用滚筒采肉机进行脱壳采肉，选取3 mm孔径网状滚筒。将采肉获得的南极磷虾肉糜在漂洗槽中以10倍水量的0 ℃冰水进行1～2次漂洗，每次漂洗10 min，漂洗后的南极磷虾肉糜进行挤压脱水。通过上述工艺分别获得未漂洗南极磷虾肉糜、1次漂洗南极磷虾肉糜和2次漂洗南极磷虾肉糜。将3种南极磷虾肉糜（虾肉糜）真空袋装后液媒速冻至－30 ℃，贮藏于－30 ℃低温冰箱备用。

1.3.2 总蛋白酶活力测定

准确称取待测样品，按1∶5（g/mL）加入0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.5）提取粗酶液。Folin酚法测定粗酶液总蛋白酶活力；以1%酪蛋白为底物，37 ℃水浴反应，每分钟水解生成1 μg酪氨酸所需的酶量为一个酶活力单位（U）[9]。105 ℃烘干恒质量法测定待测样品中干物质的质量分数。计算待测样品总蛋白酶活力，以U/g干质量表示。

1.3.3 蛋白质组分分析

参照Hashimoto等[14]方法分离待测样品的蛋白质组分，分离获得非蛋白氮（non-protein nitrogen compound，NPN）、水溶性蛋白质（water-soluble protein，WSP）、盐溶性蛋白质（salt-soluble protein，SSP）、碱溶性蛋白质（alkali-soluble protein，ASP）。凯氏定氮仪测定各蛋白质组分的总氮质量分数。

蛋白质质量分数=总氮质量分数×6.25

1.3.4 汁液流失率测定

采用离心法测定汁液流失率，取10 g待测样品于离心管，4 ℃条件下8 000 r/min离心20 min，倒去上层汁液，称量残余虾肉质量，以损失汁液占待测样品鲜质量的质量分数计算为汁液流失率。

1.3.5 感官评价

由10名评价员组成感官评价小组，对虾肉糜样品进行感官评价。感官评价以虾肉糜的肉糜色泽、组织质感、水煮气味为评价指标，各项指标为1～10分，根据表1的评分标准进行评分。取3项评价指标得分的平均值为样品的综合感官评分。

表1 南极磷虾肉糜感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of Antarctic krill paste

1.3.6 冷藏实验

将3种虾肉糜切割成片状（厚度1 cm），在5 ℃条件下进行24 h冷藏实验。于冷藏过程中，间隔一定时间取样进行总蛋白酶活力测定、蛋白质组分分析、汁液流失率测定和感官评定。

1.3.7 南极磷虾肉糜蛋白水解酶来源分析

南极磷虾整虾解冻至个体分开。随机选取20尾虾体完整饱满的南极磷虾（不区分雌雄和体长），沿头胸甲后缘切开，将虾体分为头胸部和腹部[15]。真空冷冻干燥24 h后称质量并计算南极磷虾头胸部、腹部干质占整虾干质的比例，重复测定10次。以上述方法分离虾体，分别测定南极磷虾头胸部和腹部的总蛋白酶活力，重复测定5次，并计算南极磷虾头胸部、腹部蛋白酶活力分别占整虾总蛋白酶活力的比例。

1.4 数据统计

采用SPSS 13.0软件进行数据统计分析，以one-way ANOVA分析数据，Duncan新复极差法分析平均值之间的差异。采用OriginPro 7.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 南极磷虾肉糜冷藏过程中蛋白水解酶稳定性

表2 南极磷虾肉糜冷藏过程中总蛋白酶活力的变化（x±s=5）Table 2 Changes in total proteolytic activity of Antarctic krill pastes during chilling storage (x±s , = 5)

表2所示为3种虾肉糜在5 ℃冷藏过程中总蛋白酶活力的变化。未漂洗虾肉糜的初始总蛋白酶活力最高，经过1～2次漂洗，虾肉糜的初始总蛋白酶活力分别下降49.2%、74.3%。未漂洗虾肉糜的总蛋白酶活力在5 ℃冷藏的前6 h内下降不显著，1次、2次漂洗虾肉糜则呈显著下降趋势（P＜0.05）。冷藏24 h后，未漂洗、1次漂洗虾肉糜的总蛋白酶活力分别下降为初始值的68.2%、41.6%，但蛋白酶活力数值仍较大；由此可见，磷虾肉糜中的蛋白酶在5 ℃冷藏温度条件下稳定性较高。2次漂洗虾肉糜冷藏24 h后未检出总蛋白酶活力，可能是由于其初始值较低所致。杭虞杰等[16]对南极磷虾蛋白酶热稳定性进行了研究，蛋白酶液4 ℃条件下保存60 min，残留酶活力在90%以上，同样证明了南极磷虾蛋白酶在冷藏温度条件下的稳定性。蛋白水解酶的稳定性使得漂洗不彻底的虾肉糜在冷藏过程中持续处于蛋白酶的酶解作用之下，进而表现出自溶特性。

2.2 南极磷虾肉糜蛋白水解酶来源分析

表3 南极磷虾头胸部、腹部的干质量比例和总蛋白酶活力分布比例（以干质量计）Table 3 Weight ratio (dry basis) and proteolytic activity ratio of cephalothorax and tail in whole Antarctic krill (dry basis)

由表3可知，南极磷虾头胸部干质量仅占整虾的42.82%，但其总蛋白酶活力高达857.83 U/g干质量；而腹部的肌肉组织中所含的总蛋白酶活力仅占整虾总蛋白酶活力的4.49%。3种自制虾肉糜中的总蛋白酶活力均高于南极磷虾腹部的总蛋白酶活力，可见虾肉糜中的蛋白水解酶活力主要来源于南极磷虾头胸部。Kawamura等[17]将南极磷虾头胸部和腹部分离，发现单独存放的腹部组织自溶缓慢，磷虾整虾的自溶速度近似于头胸部，并认为这是头胸部消化腺蛋白酶向腹部肌肉渗透所致。而南极磷虾采肉工艺更使得磷虾消化腺蛋白酶大量分布于虾肉糜产品中，因此，需要对虾肉糜中因蛋白酶引起的自溶特性高度重视。

2.3 南极磷虾肉糜冷藏过程中蛋白质组分变化

表4 南极磷虾肉糜冷藏过程中蛋白质组分的变化（x±s=5）Table 4 Changes in protein components of Antarctic krill pastes during chilling storage x±s , = 5)

表4所示为3种虾肉糜在冷藏过程中蛋白质组分的变化。未漂洗虾肉糜的初始蛋白质组分主要为NPN和WSP，且在冷藏中呈显著增加（P＜0.05），而SSP和ASP则呈显著减少（P＜0.05），表现为强烈的自溶特性。1次漂洗虾肉糜的初始蛋白质组分主要为ASP，这是由于漂洗降低了NPN和WSP所占的质量分数。但冷藏中，NPN、WSP同样呈显著增加（P＜0.05），SSP显著减少（P＜0.05），表现为明显的自溶特性。2次漂洗虾肉糜中NPN和WSP所占质量分数较小，且24 h冷藏中的增量较小；SSP在冷藏中仅减少了39.2%，ASP无显著变化（P＞0.05）。由此可见，2次漂洗虾肉糜的自溶特性显著弱于未充分漂洗的虾肉糜。NPN主要包括游离氨基酸、寡肽及核苷酸等物质，属于滋味物质和风味物质前体；其协同作用有助于形成复杂的风味[18]。WSP主要为肌浆蛋白和多肽，含有大量的蛋白水解酶。盐溶性的肌原纤维蛋白对组织形态和持水力的维持起重要作用。蛋白质组分的变化从蛋白质分子的层面解释了虾肉糜冷藏中自溶特性的作用机理。虾肉糜中的SSP和ASP受自溶特性影响，其降解减少会导致虾肉糜肌肉组织状态的劣化。Ellingsen等[7]研究同样指出磷虾蛋白酶会首先作用于肌肉中的SSP，将其大量水解成多肽和游离氨基酸。Kolakowski[19]研究认为南极磷虾在自溶阶段后，会进入微生物腐败阶段，进而导致气味和风味的劣化，而虾肉糜冷藏过程中大量增多的NPN和WSP则是有利于微生物繁殖的营养物质[20]。

2.4 南极磷虾肉糜冷藏过程中汁液流失率变化

图1 南极磷虾肉糜冷藏过程中汁液损失率的变化Fig.1 Changes in drip loss of Antarctic krill pastes during chilling storage

汁液流失率是衡量肉类蛋白质持水性的指标，能反映水产品肌肉在贮藏过程中的汁液流失程度，渗出的汁液会降低商品价值[21-22]。图1为3种虾肉糜5 ℃冷藏中汁液流失率的变化。漂洗虾肉糜初始汁液流失率大于未漂洗虾肉糜，主要是由于虾肉在漂洗中吸水所致。未漂洗虾肉糜在冷藏中汁液流失率持续增大（P＜0.05），且冷藏24 h后汁液流失率达到53.0%。1次漂洗虾肉糜的汁液流失率在冷藏前12 h同样呈显著增大（P＜0.05），而后增速减缓。2次漂洗虾肉糜的汁液流失率在冷藏前12 h内也有所上升，之后则无显著变化（P＞0.05）。肉类组织中肌球蛋白等结构蛋白质的质量分数和存在状态是决定肌肉持水性的关键因素[23]。蛋白质结合水脱离和自由水反复冻融是水产品肌肉在冷藏、冻藏过程中出现汁液流失现象的2个主要诱因[24]。虾肉糜中SSP所占质量分数较小是其汁液流失率初始值均较高的主要原因，而自溶特性引起的蛋白质降解则导致汁液流失率不断增大。结合2.3节中蛋白质组分的变化，分析认为未漂洗虾肉糜中的非NPN和WSP随水分大量流失是其汁液流失率激增的主要原因之一。

2.5 南极磷虾肉糜冷藏过程中感官变化

图2 南极磷虾肉糜冷藏过程中的感官评分变化Fig.2 Changes in sensory evaluation score of Antarctic krill pastes during chilling storage

感官评价是通过视觉、触觉、嗅觉和味觉综合感知食品、原料的特征和性质的科学方法，其结果具有一定主观性，但通常接近消费者和下游加工企业的判定标准[25]。3种虾肉糜5 ℃冷藏中感官评分的变化如图2所示。经过漂洗的2种虾肉糜，其初始感官评分高于未漂洗虾肉糜，处于优级。未漂洗虾肉糜的感官评分在冷藏的前9 h下降显著（P＜0.05），且冷藏3 h后感官评分即低于4分，达到差级。而1次漂洗虾肉糜的感官评分在冷藏的前6 h同样下降显著（P＜0.05），但冷藏24 h后感官评分仍处于良级。2次漂洗虾肉糜感官评分在24 h冷藏中变化趋势平缓，在12～24 h中变化不显著（P＞0.05）。由此可见，3种虾肉糜冷藏中的感官变化趋势存在较大区别，直观反应出不同虾肉糜自溶特性的差异化。未漂洗虾肉糜自溶特性显著，冷藏保存会使其感官品质快速劣化，而漂洗虾肉糜的自溶特性较弱，在短时间内适于冷藏保存，但其感官品质仍会受到不同程度的影响。

3 结 论

南极磷虾肉糜中的蛋白水解酶主要为南极磷虾头胸部的消化腺蛋白酶，在5 ℃冷藏条件下具有较高的稳定性，能持续作用于磷虾肌肉蛋白质。南极磷虾肉糜的自溶特性具体表现为盐溶性、碱溶性蛋白质的降解，水溶性组分增加，直观的体现为汁液流失率增大和感官品质劣化。不同加工方式获得的南极磷虾肉糜因其蛋白水解酶活力的差别而呈现出差异化的自溶特性强度。在3种自制磷虾肉糜中，2次漂洗虾肉糜感官评分最高且在5 ℃冷藏中自溶特性较弱，但要工业化生产高品质的南极磷虾肉糜，仍需要深入研究漂洗工艺的优化及酶抑制剂的使用。

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Stability of Proteolytic Enzymes and Autolysis Characteristics of Antarctic Krill Paste during Chilling Storage

DING Hao-chen, LI Dong-fang, ZHANG Yan-ping*, XU Gang, XU Shu-zhan, HUANG Tian-xiang
(Institute of Aquatic Products Processing, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)

Three different kinds of Antarctic krill pastes were prepared. The total proteolytic activity was adopted as an index to study the stability of proteolytic enzymes in Antarctic krill pastes during chilling storage at 5 ℃. Furthermore, the autolysis characteristics of Antarctic krill pastes were also investigated via analysis of protein components, drip loss and sensory quality. The results indicated that the proteolytic enzymes of Antarctic krill pastes which originated from its digestive organs were stable during chilling storage. The Antarctic krill paste prepared without sufficient rinsing was under durative state of autolysis during storage. The autolysis characteristics of Antarctic krill pastes mainly embodied in protein degradation, rise of drip loss and deterioration of the sensory quality. The Antarctic krill paste prepared without rinsing was not suitable for storage at refrigerated temperature, since its autolysis phenomena were particularly remarkable. However, the autolysis characteristics of Antarctic krill paste prepared by rinsing twice were not significant. The sensory quality was not seriously deteriorated though protein degradation and rise of drop loss still existed. Therefore, the Antarctic krill paste being rinsed twice was suitable for storage at refrigerated temperature within a short period of time.

Antarctic krill paste; chilling storage; proteolytic enzyme; autolysis characteristics

TS254.4

A

1002-6630（2014）04-0200-05

10.7506/spkx1002-6630-201404041

2013-05-23

国家高技术研究发展计划（863计划）项目；浙江工商大学研究生科技创新项目（1110XJ1512119）

丁浩宸（1988—），男，硕士，研究方向为水产品加工。E-mail：dinghaochen1988@126.com

*通信作者：张燕平（1962—），女，副教授，学士，研究方向为水产生物化学。E-mail：zhangyanping@zjgsu.edu.cn