双向电泳蛋白质组技术在残胃癌组织研究中的应用

孙余省 朱冠保 陶礼钧 方 军 徐洪波 林 才

1.温州医科大学附属第一医院创伤外科，浙江温州 325000；2.温州医科大学附属第一医院普外科，浙江温州 325000；3.温州医科大学附属第一医院烧伤科，浙江温州 325000

残胃癌亦称胃术后胃癌， 占所有胃癌的0.35%～5.8%。 它常发生于胃大部切除后的残胃内，也可发生在单纯胃肠吻合等术后的全胃内。 胃大部切除术后20 年以上，残胃癌发生率较一般人群高出6～7 倍[1-3]。迄今为止，其发病的分子机制仍然不明，也没有好的早期诊断方法。 因此，寻找特异的分子标志和早期诊断方法，了解残胃癌的发病机制对治疗和预后的判断都有非常重要的意义[4-6]。本研究采用双向电泳技术分离残胃癌组织与癌旁正常胃黏膜组织的所有蛋白质，运用蛋白质组学技术分析残胃癌组织与癌旁组织之间蛋白质组的表达差异， 寻找残胃癌的特异性标志物，分析差异表达蛋白谱的变化与残胃癌的发生发展之间的关系、规律，为全面阐明残胃癌的发病机制和临床残胃癌筛查和诊断以及治疗提供新的途径。

1 材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 标本采集

2010 年2 月～2011 年12 月取3 对残胃癌及癌旁正常胃黏膜组织，均来自温州医学院附属第一医院胃肠外科收治的经手术切除的残胃癌患者， 其中女2例，男1 例，年龄59～75 岁，平均67 岁。 3 例患者均经术后病理学检验，确诊为胃术后“吻合口”低分化腺癌。从肿瘤的非坏死组织中获得残胃癌组织作为观察组， 并从患者距离原发肿瘤在5 cm 以上的胃黏膜层组织获得正常组织作为对照组。 其中，所有癌旁正常胃黏膜组织标本均经病理学检验，证实不存在癌细胞浸润。 所有残胃癌组织标本经病理学检验，证实肿瘤浸润仅穿透浆膜层。 待所有标本离体之后，立即予以取材，并利用生理盐水冲洗多次之后放入液氮中。 将所有标本均置于-80°C 的环境下，储存备用。

1.1.2 主要试剂

固相pH 梯度干胶条 （13 cm， 宽pH 范围）、IPG buffer 购自通用电气医疗集团生命科学部；丙烯酰胺、甘氨酸、甲基双丙烯酰胺均购自上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂；十二烷基硫酸钠（SDS）购自湖北鸿运隆生物科技有限公司；尿素购自张家港丰达制药有限公司；3-[3-（胆酰胺基丙基） 二甲氨基] 丙磺酸盐、 过硫酸铵和N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）均购自北京瑞达恒辉科技发展有限公司；3-[（3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）、二硫苏糖醇（DTT）均购自上海嵘崴达实业有限公司；碘乙酰胺购自武汉济森医药化工有限公司；BCA 蛋白浓度试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；UPD-D 蛋白质染料染色试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；UPD-蛋白质染料染色试剂盒购自温州安得森生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器

超声波细胞粉碎机（购自宁波先倡电子科技有限公司）；IPGphorⅢ等电聚焦仪器 （购自上海将来实验设备有限公司）；DYY-6C 双稳定时电泳仪（购自安徽东南仪诚实验室设备有限公司）；脱色摇床[购自创博环球（北京）生物科技有限公司]；冷冻台式高速离心机 （购自江苏省金坛市恒丰仪器制造有限公司）；SDS-PAGE 垂直电泳仪（购自北京君意东方电泳设备有限公司）；Powerlook 2100XL 扫描仪[购自世群国际贸易（上海）有限公司]，ImageMaster 2D platinum 6.0图像分析软件（购自通用电气医疗系统贸易发展上海有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取组织总蛋白

将组织标本100 mg 快速浸于液氮之中， 充分研磨，达到粉末状后，加入裂解液（7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，40 mmol/L Tris，0.5% TritonX-100，65 mmol/L DTT，0.5%pharmalyte，1%蛋白 酶抑 制 剂cocktail）1 mL。 予以涡旋振荡，达到混匀充分之后，置冰上进行1 h 裂解。应用超声细胞破碎仪处理10 min，避免出现气泡， 然后以15 000 r/min，4℃进行30 min离心。 组织总蛋白质提取液即为最终的上清液。 利用BCA 试剂盒对蛋白的浓度进行检测， 并进行分装，然后置于-80℃环境下存放备用[7]。

1.2.2 凝胶电泳

1.2.2.1 水化上样 从水化盘槽的边缘， 从左至右，线性加入250 μL 样品。取出存放在冰箱中的IPG 胶条，置于室温环境下10 min。 然后将胶条胶面朝下，轻轻放置在水化盘中的样品溶液上。静置30～45 min，待胶条吸收大部分样品之后， 将矿物油沿胶条缓慢加入。每根胶条（17 cm IPG）在3 mL 左右，避免水化过程中液体蒸发。 将等电聚焦仪于-20℃予以11～15 h 水化。

1.2.2.2 第一向等电聚焦 于聚焦盘的正负极上放置纸电极置，加5～8 μL ddH2O 进行润湿。取出水化完毕的IPG 胶条，放在聚焦盘中。 并利用2～3 mL 矿物油覆盖每根胶条。对等电聚焦程序进行设置，具体如下：50 V，4 h；100 V，3 h；500 V，1 h；1000 V，1 h；5000 V，1 h；8000～50 000 V，10 h，重复3 次。 待聚焦结束之后，将胶条置于样品水化盘中， 并放在-20℃的冰箱中保存备用，或者立即对胶条予以平衡。电泳之前，将胶条取出，并放置在室温环境下予以溶解。

1.2.2.3 第二向SDS-PAGE 电泳 IPG 胶条分别置于10 mL 平衡缓冲液Ⅰ（6 mol/L 尿素，2%SDS，0.05mol/L Tris-HCl， pH 8.8， 30% 甘油包含2%二硫苏糖醇）和平衡缓冲液Ⅱ（250 mg 碘乙酰胺的平衡液）摇床上各平衡15 min，在1×电泳缓冲液中漂洗数次，然后安放在12%的丙烯酰胺凝胶上，加入低熔点琼脂糖封胶液封闭。先进行10 mA/17 cm，15℃电泳。仔细观察，在样品在全部走出IPG 胶条并浓缩为一条线之后， 增大电流强度，保持在20～30 mA/17 cm。 再次予以观察，如果溴酚蓝指示剂到达底部边缘，即表示电泳完成[8]。

1.2.2.4 染色 利用UPD-蛋白质染料染色试剂盒进行染色。在完成电泳之后，对凝胶予以小心的剥离，并置于蒸馏水中进行漂洗，并严格参照产品说明书中的具体步骤染色。

1.2.2.5 扫描分析图像 利用光密度投射模式完成扫描，并以TIF 格式予以妥善保存。 利用分析软件对图像予以分析。比较3 块重复的胶图，合成标准图谱。采用软件进行两两对比分析，如果表达量差距在2 倍以上，则视为存在明显的差异表达，并得出差异表达蛋白点的具体数据[9]。

2 结果

2.1 蛋白双向凝胶电泳

对3 对残胃癌和癌旁组织分别进行了多次重复双向凝胶电泳，选取背景清晰、分辨率高、无扭曲、拖带的胶图各3 张， 共18 张进行分析。 利用Image-Master 2D platinum 6.0 软件进行分析之后可得，癌旁组织平均984 个蛋白点， 残胃癌组织凝胶平均1068个蛋白点。 进行多对两两比较之后可得，在匹配的蛋白点方面，癌旁组织一共有883 个蛋白点，残胃癌组织一共有886 个蛋白点。癌旁组织和残胃癌组织的平均匹配率分别为89.8%和81.8%。 残胃癌组织和癌旁组织的蛋白双向电泳凝胶图见图1。18 块凝胶的蛋白点统计情况见表1。

图1 2-D 电泳凝胶图

表1 18 块凝胶的蛋白点统计

2.2 残胃癌组织中差异表达的蛋白情况

通过胶图比对和软件分析，将所有残胃癌组织的胶图合成一个虚拟胶图，同样所有癌旁组织胶图也合成为一个虚拟对照胶图，再进行比较。 在残胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织中发现两者间共有112 个差异表达的蛋白点，其中显著差异（表达差异2 倍以上）的蛋白点42 个。 在这42 个蛋白点之中，在残胃癌组织里表达上调的一共有17 个点； 在残胃癌组织里表达下调的一共有14 个点； 在残胃癌组织中失表达的一共有8 个点；仅在残胃癌组织中表达的一共有3 个点。 部分差异表达蛋白见图2。

3 讨论

机体的各种正常生命活动或者异常的疾病发生过程都是各种复杂因素相互作用的结果，其中以各种蛋白质的相互作用最为重要，因为蛋白质是生命的组成和生命活动的物质基础[10-11]。 全面研究各种蛋白质在疾病的发生过程中的变化比单一研究某个蛋白的作用无疑具有更大的优势，更能准确、全面了解真实的疾病发生原理。 1994 年，“蛋白质组（proteome）”概念诞生。 该概念是由澳大利亚学者Williams 以及Wilkins 经过大量的研究提出的，并认为蛋白质组指的是对一种组织或者细胞中所有蛋白质的相关研究[12]。随着现代研究的不断深入，蛋白质组相关理论研究和技术水平等都得到了较大的发展，被广泛应用于对各种疾病的发生和发展的研究之中，成为一种重要的研究工具， 尤其是在人类基因组计划完成之后，“组学”研究更是成为生命科学的重要研究方向。在功能基因组以及后基因组的研究过程中，蛋白质组的研究又显得尤其重要，因为蛋白质才是绝大数基因功能的最终执行者[13]。 目前国际国内对胃癌的研究中，有许多的学者都已经采用蛋白质组学技术在蛋白水平上大规模的研究肿瘤特异性的蛋白表达变化，如国内学者Li等[8]2008 通过蛋白质组研究发现胃癌组织中表达上调的蛋白主要集中在：①转录调节蛋白，如锌指蛋白；②信号转导蛋白，如G 蛋白信号3 蛋白（RGS3）；③肿瘤相关蛋白，如ras 相关蛋白；④细胞骨架蛋白，如大疱性类天疱疮抗原1。 一些学者也做过类似的胃癌比较，发现了很多类型的胃癌中表达上调的蛋白，例如转胶蛋白和热休克蛋白27 及其异构体， 以及抗增殖蛋白和NSP3， 还有葡萄糖代谢相关蛋白以及二硫化物异构酶A3 蛋白等。 而表达上调的蛋白也有很多类型，例如P20 和二磷酸核酸异构酶A，以及载脂蛋白A-1 和抗胰蛋白酶等。 另外，血清转铁蛋白是表达下调的蛋白[14]。

目前针对残胃癌组织与癌旁组织的蛋白质组研究还未见报道。本研究在提取残胃癌组织蛋白的过程中，笔者予以了适当的提取优化，即将组织标本快速浸于液氮之中，充分研磨，达到粉末状后，加入裂解液，并予以涡旋振荡，达到混匀充分。这样的提取过程可以对蛋白质的溶解性予以改善。 同时在裂解处理后，采用超声破碎处理，克服提取液中由于包含基因组DNA 而比较黏稠，会影响后期电泳结果，造成拖带现象的缺点[15]。 研究结果显示，2-D 胶图上背景较少，蛋白质点清晰，重复性较好，达到进一步分析的要求。另外，在研究蛋白质组的过程中，凝胶蛋白质染色技术会对最终的质谱分析等产生较大的影响。 因此，研究过程中，还需要做好染色环节。本研究中，笔者即利用UPD-蛋白质染料染色试剂盒进行染色。 在完成电泳之后，对凝胶予以小心的剥离，并置于蒸馏水中进行漂洗，严格参照产品说明书中的具体步骤染色。

图2 残胃癌组织中差异表达的蛋白情况

同时，本研究采用以相同的实验条件、相同的试剂和实验参数同时研究癌组织和癌旁组织，从凝胶图谱上看，具有很好的重复性和可比性，也证明了双向电泳技术分离蛋白质的效果良好，是研究癌症组织蛋白质组的有力工具。本研究的第一向等电聚焦采用了pH 3～10 的IPG 胶条，基本上覆盖了绝大部分的残胃癌组织和癌旁组织表达的蛋白质谱，能够全面反映其蛋白质组的分布。但是，在胶图中也发现，大部分的蛋白质多集中在pH 5～8 之间， 给具体的分析过程带来一定的难度。于是，分析的过程中，高丰度表达的蛋白可能会对于低丰度表达的一部分蛋白质造成不同程度的掩盖。 因此，进一步的研究应该继续采用高分辨的窄pH 范围的胶条，比如pH 3～8， pH 7～10 的胶条来做进一步的分离。双向电泳分离蛋白质只是蛋白质组研究的第一步，下一步应该采用各种蛋白酶切加质谱分析技术， 例如MALDI-TOF-MS 等来对出现差异表达的蛋白点代表什么蛋白质予以进一步的鉴定，并进一步分析其代谢途径和信号通路， 即所谓的Pass way 分析。 通过更加深入的分析研究，争取了解疾病的发病机制，才能进一步发现新的治疗策略和诊断方法[16]。 总之，在各种人类重大疾病的预防诊治研究过程中，蛋白质组学是一个十分重要的研究课题，可以提高人们“全景式”病理机制认识水平。 另外，关于蛋白质组学的研究还具有极强的研究前景，各种新型药物靶标与药物的研发将会给各种疾病患者带来巨大的福音，并为各种疾病对治疗提供新的思路。

综上所述，利用双向电泳蛋白质组技术对残胃癌组织进行研究，可以获得质量良好的胃癌组织蛋白质组双向电泳图谱，应用效果良好。

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