EDC和NHS对玉米醇溶蛋白成膜性质的影响

张 敏，陈 野，刘 君，周淑红，王君予，李燕丹

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

EDC和NHS对玉米醇溶蛋白成膜性质的影响

张 敏，陈 野*，刘 君，周淑红，王君予，李燕丹

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

为提高玉米醇溶蛋白膜的抗拉强度和伸长率，降低其水蒸气透过率和吸水率，研究交联剂1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）对成膜性质的影响。结果表明：以90%乙醇为溶剂，EDC和NHS的添加量分别为0.06 g/g时，制得的膜性能最佳，抗拉强度为83 MPa，较未添加交联剂的蛋白膜提高97.6%；伸长率为5.5%，提高57.1%；水蒸气透过率为2.5×10-8（g·m）/（m2·h·Pa），降低43.2%；吸水率为39.4%，降低24.4%；质量损失率为3.6%，增加20.0%；静态接触角为67.4°，表 明膜表面仍为疏水表面。原子力显微镜观测显示，加入交联剂后，蛋白分子聚集体变小，以均一的小球型聚集体形式紧密有序排列。

1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）；玉米醇溶蛋白；成膜性质

玉米醇溶蛋白，由于含有大量的非极性氨基酸，缺乏碱性和酸性的氨基酸而具有独特的溶解性。它不溶于水，但可溶于醇溶液、高浓度的尿素溶液、高浓度的碱（pH≥11）或阴离子活性剂[1]，其中乙醇溶液是最常用的溶剂。玉米醇溶蛋白能溶于50%～90%乙醇，但不溶于无水乙醇（甲醇除外）。然而，温度高于溶剂的沸点时，玉米醇溶蛋白能溶于高浓度的乙醇甚至无水乙醇溶液[2]。且在溶液中，玉米醇溶蛋白有聚集趋向[3]。玉米醇溶蛋白是由平均相对分子质量为25 000～45 000的蛋白质组成的混合物，分子是棒状的，以长短轴比为6∶1的不对称拉长分子结构存在[4-5]。玉米醇溶蛋白是相对疏水性高和热塑性好的材料，具有极强的成膜性，它是通过蛋白间疏水键、氢键和有限的二硫键形成膜[6-7]。在众多的可食性薄膜中，唯有玉米醇溶蛋白可在无需添加剂、鞣制剂的条件下制成薄膜，并且具有良好的阻湿性及阻氧性，因而可以用于食品保鲜、包装以及制药行业[8]。但由天然玉米醇溶蛋白所制得的膜机械强度低，柔韧性差，脆而易碎，限制了其工业化应用。

为了改善膜的性质，目前研究大多集中在酰化改性和磷酸化改性上。尤其是酰化改性研究较多，包括添加增塑剂、酸酐、柠檬酸等[9]。这些方法都能提高膜的一些性质，但整体性质仍然较差，尤其是脆而易碎的问题，一直未能解决。有些改性方法复杂，较难操作，或引入了有毒物质。利用1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide，EDC）做交联剂，其最终一个分子的羧基和另一分子的氨基之间可以形成酰胺键，但EDC本身并没有成为实际交联的一部分。N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）能促进以上的交联反应。反应机制如图1所示[10]。水溶性的碳化二亚胺EDC与玉米醇溶蛋白的羧基反应，通过酰胺结合形成活泼的共价偶联物O-酰基脲中间体。随后，另一玉米醇溶蛋白分子的氨基通过亲核攻击，最终与玉米醇溶蛋白分子的羧基链接，同时释放出水溶性的尿素衍生物。O-酰基脲非常活泼，如果不与氨基反应，则会很快水解并重新释放出羧基基团。NHS促进了该反应，与含羧基的化合物反应，形成酰胺基酯类。与氨基反应的速度相比，该酯类的水解要缓慢的多。因此NHS提高了碳化二亚胺结合羧酸盐化合物与一级胺类的链接效率[10-11]。

图1 利用EDC和NHS改善膜性质的反应机理[[1100]]Fig.1 Schematic showing amide bond formation from zein molecules reacted with EDC and NHS[[1100]]

由于EDC具有无毒、生物相容性良好等特点[12]，目前已被用作胶原、纤维蛋白凝胶、麦谷蛋白膜、鱼胶膜等的交联剂。

玉米醇溶蛋白中含有大量的非极性氨基酸，在水中的溶解度比极性氨基酸要小，因此溶剂中水的含量将直接影响玉米醇溶蛋白的溶解度[13]。也就是说在不同体积分数的乙醇溶液中，玉米醇溶蛋白的溶解度也不同。此外，玉米醇溶蛋白是两性分子，空间结构上既有亲水基团也有疏水基团，膜的耐水性与其分子亲水基团、疏水基团的空间排列结构有关[14]。乙醇是半极性分子，高体积分数乙醇可以破坏维持醇溶蛋白在乙醇溶液中形成的胶体稳定的某些重要作用力（如氢键），而使醇溶蛋白的空间结构发生变化，使原来包埋在内部的疏水基团暴露于蛋白表面并与乙醇的疏水基团结合，生成疏水层，得到高耐水性的膜[15]。因此乙醇体积分数将显著影响成型模的性质。

本实验采用EDC和NHS作为交联剂，研究了不同乙醇体积分数、不同EDC和NHS含量条件下玉米醇溶蛋白膜的性质，并通过原子力显微镜观测了蛋白的微观结构，研究玉米醇溶蛋白膜的成膜规律及EDC和NHS对成膜性质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米醇溶蛋白 江苏高邮日星药用辅料有限公司；无水乙醇（分析纯） 天津市化学试剂一厂；1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

WDW-20H型微机控制电子式万能试验机 济南中路昌试验机制造有限公司；DGG-101-OBS型电热鼓风干燥箱 天津市天宇实验仪器仪表公司；JY-82A型视频接触角测定仪 承德鼎盛试验机检测设备有限公司；JSPM-5200型原子力显微镜 日本电子公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白膜的制备

取80%、85%、90%、95%的乙醇溶液各20 mL，于60℃水浴中加热3 min，分别加入2 g玉米醇溶蛋白，混合均匀后再于60℃水浴中加热10 min，将溶液倒于成膜模具中，室温下干燥成膜。膜于相对湿度为50%的干燥器中平衡1周。

1.3.2 改性玉米醇溶蛋白膜的制备

如前述，在加入玉米醇溶蛋白的同时，加入EDC和NHS（以玉米醇溶蛋白质量为基准），EDC的添加量分别为0.05、0.06、0.07、0.08 g/g，NHS的添加量分别为0.05、0.06、0.07、0.08 g/g。其余步骤同1.3.1节。

1.3.3 膜的机械性质测定

将平衡后的膜裁成10 mm×100 mm的长条，有效测定长度为50 mm。用螺旋测微器测量膜的厚度，每个长条随机测5个点，以平均值作为膜的厚度。万能试验机的拉伸速率为10 mm/min。每个试样平行5次，以平均值作为抗拉强度和伸长率。

1.3.4 膜的水蒸气透过率的测定

将膜裁成圆片，用螺旋测微器测量膜的厚度，每个圆片随机测5个点，以平均值作为膜的厚度。将圆片密封在测试杯上，有效测量面积为半径15 mm的圆，每个杯里放置10 g无水CaCl2，然后置于相对湿度90%、温度25℃的环境中，每隔24 h，测试杯子的质量。膜的水蒸气透过率的计算见式（1）。

式中：WVP为水蒸气透过率/（10-8（g·m）/（m2·h·Pa））；m为杯子的增加质量/g；L为膜的厚度/m；t为测试时间/h；S为膜的测试面积/m2；ΔP为膜的内外水蒸气压差/Pa。

1.3.5 膜的耐水性测定

测量膜的吸水率和质量损失率来表征膜的耐水性。样品在50℃条件下恒温干燥（24±1）h，干燥器中冷却后称质量m1，干燥后的样品放在（23±0.5）℃的纯净水中浸渍（24±1）h后取出，用干燥洁净的纱布擦干，在1 min内放在称量瓶中，称得吸水后的质量m2；再将吸湿后的样品于50℃恒温干燥（24±1）h，冷却后称质量m3。每个样品平行测5次，计算其平均值。

1.3.6 膜的表面疏水性测定

测量膜的动态接触角和静态接触角来表征膜的表面疏水性。采用躺滴法测量。将5 μL去离子水滴在玉米醇溶蛋白膜的表面，以5次/s的速率连续拍照10 s，记录液滴在膜表面的形状变化，测定接触角。所有膜都是以90%乙醇为溶液所成的膜，采用膜的正面，每张膜随机测定5个点。

同上法测量膜正面的动态接触角，以平衡接触角作为静态角。每个样品测量5个点。

1.3.7 膜的原子力显微镜观测

取80%、85%、90%、95%的乙醇溶液各50 mL，于60℃水浴中加热3 min，分别加入0.005 g玉米醇溶蛋白，混合均匀后再于60℃水浴中加热10 min，取20 μL滴于云母片上，干燥后进行原子力显微镜扫描，采用轻敲模式，扫描面积为2 μm×2 μm，扫描速率为333.3 μs。改性膜为在加入玉米醇溶蛋白的同时加入0.0003 g EDC和0.0003 g NHS，其余同上。

2 结果与分析

2.1 EDC和NHS对玉米醇溶蛋白膜机械性质的影响

图2 EDC和NHS对膜抗拉强度的影响Fig.2 Effect of EDC and NHS on the tensile strength of zein films

由于以60%、70%乙醇为溶剂所成的膜表面龟裂较多，不能完整成膜，实验未采用。由图2可知，随着乙醇体积分数从80%增加到95%，膜的抗拉强度先升高后降低，在90%时达到最大值。这是由于玉米醇溶蛋白中含有大量的非极性氨基酸，在水中的溶解度比极性氨基酸要小，因此溶剂中水的含量将直接影响玉米醇溶蛋白的溶解度[13]。随着乙醇体积分数的增高，溶液中水含量降低，非极性氨基酸充分溶解，同时在热作用下组织化变性，从而使成型模具有高的抗拉强度。当乙醇体积分数达到95%时，玉米醇溶蛋白的溶解度降低，产生沉淀，溶液中蛋白含量减少，所以成型膜的抗拉强度较90%时减小。

根据Kim等[10]的研究，EDC和NHS作为交联剂等量加入。预实验中，以90%乙醇为溶剂，EDC和NHS的加入量均为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g/g。结果表明两者添加量为0.02、0.04 g/g的玉米醇溶蛋白膜成膜不均匀，成型的膜脆度仍较大，表明交联剂添加量不足，不能和所有玉米醇溶蛋白反应。当两者添加量达到0.1 g/g时，膜的抗拉强度与0.08 g/g时相比降低较大，表明此时添加过量。因此两者添加量选为0.05、0.06、0.07、0.08 g/g。在此条件下加入EDC和NHS后，膜的抗拉强度均大幅提高。在两者添加量为0.06 g/g时抗拉强度达到最大。以90%乙醇为例，未改性膜的抗拉强度为42 MPa，EDC和NHS的添加量分别为0.06 g/g时，抗拉强度为83 MPa，提高了97.6%。这是由于加入交联剂后，玉米醇溶蛋白分子间发生了交联。

图3 EDC和NHS对膜伸长率的影响Fig.3 Effect of EDC and NHS on the elongation of zein films

由图3可知，未改性蛋白膜的伸长率很小，添加EDC和NHS后，膜的柔韧性大大提高，变得很柔软，几乎没有裂口和碎片现象，伸长率也有所提高。在乙醇体积分数为95%、添加量为0.08 g/g时达到最大值10%，是相同乙醇体积分数条件下未改性蛋白膜的4倍。Yang Yiqi等[16]认为，玉米醇溶蛋白成型物易脆及延伸性差是因为在乙醇溶液中制备时，玉米醇溶蛋白蛋白不能完全展开，以致大量的侧链基团阻止多肽互相接近，并以有序的结构排列或在膜轴心定向排列。添加交联剂后伸长率的显著提高可能是因为大量的侧链基团间发生交联，形成网状结构，从而膜的柔韧性和延展性都有所提高。乙醇体积分数为90%，EDC和NHS的添加量各为0.06 g/g时，膜的抗拉强度最大，此时玉米醇溶蛋白分子间作用力最大，因此伸长率较小，为5.5%。但与90%乙醇体积分数条件下的未改性蛋白相比，仍提高了57.1%。

综上所述，添加EDC和NHS能显著提高玉米醇溶蛋白膜的机械性质。

2.2 EDC和NHS对玉米醇溶蛋白膜水蒸气透过率的影响

图4 EDC和NHS对膜水蒸气透过率的影响Fig.4 Effect of EDC and NHS on the water vapor permeability of zein films

由图4可知，随着乙醇体积分数的增加，玉米醇溶蛋白膜的水蒸气透过率先降低后升高，在90%时达到最低值。这是由于在90%的乙醇溶液中，玉米醇溶蛋白分子溶解更充分，分子间结合力大，分子间隙小，因此水蒸气透过率低。加入EDC和NHS后，膜的水蒸气透过率大大降低，在添加量为0.06 g/g时水蒸气透过率降到最低。以90%乙醇为例，未改性膜的水蒸气透过率为4.4× 10-8（g·m）/（m2·h·Pa），当添加量为0.06 g/g时，该值降低到了2.5×10-8（g·m）/（m2·h·Pa），降低了43.2%。这是由于玉米醇溶蛋白分子发生交联，分子间隙变得更小，聚集体蛋白链片段移动性降低，因此交联剂的加入大大降低了膜的水蒸气透过率。而以95%乙醇为溶剂，当交联剂含量增加到0.08 g/g时，水蒸气透过率显著增加，几乎与未改性蛋白膜相等，这可能是由于玉米醇溶蛋白分子过多的交联，难以在95%的乙醇中充分溶解，从而造成分子间力降低，分子间隙较大。

2.3 EDC和NHS对玉米醇溶蛋白膜耐水性的影响

吸水率是耐水性的重要指标，通常情况下，吸水率越低，膜耐水性越好。由图5可知，随着乙醇体积分数的增加，膜的吸水率先降低后升高，在90%时达到最小值52.2%。玉米醇溶蛋白溶于乙醇溶液后会形成微束结构蛋白聚集体，成型膜是各玉米醇溶蛋白分子聚集体的结合体。膜的耐水性与玉米醇溶蛋白分子亲水基团、疏水基团的空间排列结构有关[14]。当乙醇体积分数低于90%时，亲水基团在微束聚集体外侧，随着乙醇体积分数升高，水合粒径逐渐减小[15]，因此吸水率逐渐降低。当乙醇体积分数高于90%时，高体积分数乙醇破坏了维持玉米醇溶蛋白在乙醇溶液中形成的聚集体的稳定性，埋在内部的疏水基团暴露于蛋白表面生成疏水层。此时膜的吸水率应该降低。但实际上，膜的吸水率升高了。这是因为当乙醇体积分数高于90%时，随着乙醇体积分数升高，玉米醇溶蛋白分子的水合粒径逐渐增大[15]，95%的乙醇溶液不能完全溶解它，造成膜的结构较松散，水分子更容易渗透到蛋白内部。随着交联剂的增加，吸水率先降低后升高，当EDC和NHS的添加量均为0.06 g/g时，吸水率最低，为39.4%，降低了24.4%。加入低量的EDC和NHS后，膜的吸水率降低，这是因为玉米醇溶蛋白分子发生交联，分子间力增大，膜结构致密，水分子不易渗透到蛋白内部。而高含量的交联剂使玉米醇溶蛋白分子过分交联，不能在乙醇溶液中完全溶解，膜结构变得松散，水分子较容易渗透到蛋白内部。

图5 EDC和NHS对膜吸水率的影响Fig.5 Effect of EDC and NHS on the water absorption of zein films

图6 EDC和NHS对膜质量损失率的影响Fig.6 Effect of EDC and NHS on the weight loss of zein films

由图6可知，随着乙醇体积分数的增加，膜质量损失率先降低后增高，在90%时达到最低值3.0%。这是因为乙醇体积分数为90%时，膜分子间力最大，分子间隙最小，物质最难溶出。当膜浸泡在水中时，一方面膜会吸水，另一方面，膜中的某些成分会溶出到水中，造成膜的质量损失。因此质量损失率与膜的耐水性相关[17]。通常，疏水材料的质量损失率比亲水材料的要低。加入交联剂后，膜质量损失率比未改性时增加，证明耐水性降低。这是因为EDC和NHS是水溶性的，当膜浸泡在水中时，部分交联剂会逐渐迁移到膜表面，最后溶入到水中，造成膜质量损失率增加。而随着交联剂含量增加，膜质量损失率先降低后增加，在EDC和NHS的添加量均为0.06 g/g时最低，为3.6%，这是因为该含量条件下，玉米醇溶蛋白分子结合最紧密，交联剂较难溶出。

2.4 EDC和NHS对玉米醇溶蛋白膜表面疏水性的影响

图7 EDC和NHS对膜动态接触角的影响Fig.7 Effect of EDC and NHS on the dynamic contact angle of zein films

图7中所有膜的溶剂均为90%的乙醇溶液。实际应用中，液体在固体表面的润湿行为是一个动态过程，从液滴接触固体表面的瞬间开始，由固、液、气三相组成的润湿线是随时间而移动，移动过程中无法达到平衡，在任意时刻润湿线所产生的接触角称为动态接触角，动态接触角变化情况受到固体表面、测试液滴的黏度和表面张力影响[18]。水在膜表面形成接触角的大小一定程度上反映膜表面的疏水性质，接触角越大，疏水性越好。通常，形成较大的接触角的表面（θ＞65°）为疏水表面，而具有较小接触角的表面（θ＜65°）为亲水表面[19]。由图7可知，随着时间延长，所有膜的接触角呈先下降后稳定的趋势。稳定时的接触角为平衡接触角。接触角时间依赖性主要是由于水滴与聚合物接触后其表面发生重构引起，起始接触角与平衡接触角则分别与聚合物表面疏水性组分和亲水性组分相关[20]。未改性蛋白的平衡接触角为68.9°，证明此时膜为疏水表面。加入交联剂后，接触角都有所下降，证明膜的表面疏水性降低。这是因为EDC和NHS均是亲水的，更易与水结合，从而使接触角减小。而随着交联剂含量增加，膜接触角先增大后减小，在EDC和NHS的添加量均为0.06 g/g时最大，为67.4°，比未改性时减小了2.2%，此时仍为疏水表面。此含量下，交联剂和玉米醇溶蛋白分子结合最紧密，所以表面疏水性最好。其他膜接触角均小于65°，为亲水表面。

由图8可知，未改性蛋白膜的接触角随着乙醇体积分数的增加，先增大后减小，在90%时达到最大，为68.9°，此时为疏水表面。加入交联剂后，接触角均减小，证明膜的表面疏水性降低了。随着交联剂含量增加，接触角先增大后减小，在EDC和NHS的添加量均为0.06 g/g时最大。

图8 EDC和NHS对膜静态接触角的影响Fig.8 Effect of EDC and NHS on the static contact angle of zein films

2.5 原子力显微镜图

图9 玉米醇溶蛋白膜原子力显微图（2 μm×2m2 μm）Fig.9 Atomic force microscope photographs of zein films (2 μmm×2 μmm)

由图9可知，许多圆形或椭圆形的蛋白小球，每个小球都是由许多玉米醇溶蛋白单体聚集而成的蛋白聚集体。它们大小的不均匀性，可能是由于聚集程度的不同造成的[21]。纯蛋白膜的聚集体排列不是特别紧密，随着乙醇体积分数的升高，聚集体间隙先减小后增大，在90%时排列紧密，间隙最小，所以膜的整体性质，在乙醇体积分数为90%时达到最佳。加入交联剂后，聚集体尺寸明显变小，且大小均一，排列紧密。这证明EDC和NHS阻碍了玉米醇溶蛋白的聚集。Kim等[10]用动态光散射技术证明，EDC和NHS阻碍了玉米醇溶蛋白在乙醇溶液中的聚集。本研究结果与其一致。造成该现象的原因可能是加入交联剂后，玉米醇溶蛋白分子间发生交联，形成聚集体，当交联的数目达到一定时，玉米醇溶蛋白分子间不再交联，而聚集体之间发生交联，最终形成了排列紧密的结构。这些结构是一层层的，许多层结合在一起，从而形成了玉米醇溶蛋白膜。也就是说这些聚集体形成的结构构成了膜的结构基础。由于排列紧密，间隙小，分子间作用力增大，所以加入交联剂后，玉米醇溶蛋白膜的性质有显著提高。

3 结 论

未改性玉米醇溶蛋白膜在乙醇体积分数为90%时，各项性质优于80%、85%和95%乙醇条件下所制得的膜，但膜柔韧性差，抗拉强度较低。添加交联剂EDC和NHS能显著提高膜的抗拉强度和柔韧性，降低水蒸气透过率。这是因为加入交联剂后，玉米醇溶蛋白分子间发生了交联，最终，玉米醇溶蛋白分子的羧基与另一蛋白分子的氨基交联，分子间结合力增大，分子间隙减小。

通过原子力显微镜观测，蛋白呈圆形或椭圆形的小球，这是玉米醇溶蛋白的蛋白聚集体。纯蛋白膜的聚集体均一性差，排列不紧密，在乙醇体积分数为90%时排列紧密，间隙小。加入交联剂后，聚集体尺寸明显变小，且大小均一，排列紧密，间隙小，证明EDC和NHS阻碍了玉米醇溶蛋白的聚集。

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Effects of EDC and NHS on Physical Properties of Zein Films

ZHANG Min, CHEN Ye*, LIU Jun, ZHOU Shu-hong, WANG Jun-yu, LI Yan-dan
(College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

The effects of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) as crosslinking reagents on the structure and properties of zein fi lms were investigated to fi nd ways to improve the tensile strength and elongation and reduce the water vapor permeability and moisture absorption. Results showed that fi lms prepared with 90% ethanol as the solvent and 0.06 g of EDC/g zein or 0.06 g of NHS/g zein exhib ited the best properties. The tensile strength, elongation, water vapor permeability, moisture absorption and weight loss were 83 MPa, 5.5%, 2.5 × 10-8(g·m)/ (m2·h·Pa), 39.4% and 3.6%, which were increased by 97.6%, 57.1%, reduced by 43.2% and 24.4%, and enhanced by 20.0% compared to those without added cross-linking reagent, respectively, and the static water contact angle of the experimental samples was 67.4°, indicating the fi lm surface to be hydrophobic. In addition, the surface of zein fi lms containing EDC and NHS was arranged orderly and closely as smaller uniform spherical aggregates as observed using atomic force microscope (AFM)

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC); N-hydroxysuccinimide (NHS); zein; fi lm properties

TQ321.4

A

1002-6630(2014)01-0012-06

10.7506/spkx1002-6630-201401003

2012-10-16

国家自然科学基金面上项目（31071634）

张敏（1987—），女，硕士研究生，研究方向为食品产品与技术开发。E-mail：zm1112011@163.com

*通信作者：陈野（1968—），男，教授，博士，研究方向为农产品加工。E-mail：chenye@tust.edu.cn