FAK、NF－κB及VEGF在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

张柯晴 吕坤聚 朱君祥

（中国人民解放军第401医院呼吸内科；1青岛大学医学院，山东266000）

肺癌是目前世界上对人类健康威胁最大的恶性肿瘤之一，全球每年约有135万人被确诊为肺癌，120万人死于肺癌［1］。虽然医学技术有了长足发展，但肺癌患者的5年存活率并未得到明显改善，仅为15%左右［1］，其中非小细胞肺癌占肺癌总数的80%－85%［2］。其根本原因在于肺癌发病机制尚不明确，临床缺乏早期的诊断和治疗手段。20世纪90年代以来，信号传导通路逐渐成为肿瘤学领域研究的热点。本研究应用免疫组化的方法检测FAK、NF－κBp65及VEGF－C在NSCLC组织及癌旁正常组织中的表达情况，以期探讨三者与NSCLC分化程度、临床分期及淋巴结转移等的关系。

材料和方法

1．标本与资料

收集2012年12月至2013年12月解放军第四零一医院胸外科手术切除的NSCLC石蜡标本75例（标本要求：1．术前未进行过化疗和（或）放疗者；2．无合并其他器官原发性肿瘤者；3．组织块石蜡包埋充分）。在75例NSCLC标本中，鳞癌42例，腺癌33例；男性60例，女性15例；最小年龄41岁，最大年龄78岁，平均年龄60．6岁。随机选择30例NSCLC癌旁正常组织作为对照。入选标本的组织学类型，分化程度及分期等均经病理科医师确诊。

2．方法与试剂

石蜡包埋的组织块经4μm厚连续切片，采用免疫组织化学Envision二步法检测FAK、NF－κBp65及VEGF－C在75例NSCLC及癌旁组织标本中的表达。步骤如下：切片脱蜡至水后EDTA缓冲液高压修复抗原，3%过氧化氢溶液封闭，加一抗（FAK稀释比例1∶50，NF－κBp65稀释比例1∶200，VEGF－C为即用型）后4℃孵育过夜，加二抗37℃反应，最后DAB显色，苏木素复染，封片观察。鼠抗人单克隆抗体FAK购于美国Santa Cruz公司，兔抗人多克隆抗体 NF－κBp65、兔多抗 VEGF－C及显色试剂盒均购自中杉金桥生物技术有限公司。

3．结果判断

FAK及VEGF－C的表达主要位于胞浆，染色阳性信号颗粒呈棕黄色；NF－κBp65的表达主要位于胞核和胞浆，染色阳性信号颗粒呈棕黄色。染色强度分级标准：通过光学显微镜观察无色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；深褐色为3分。着色细胞百分率计分：每张切片随机选取10个高倍视野（×400）下计数着色细胞百分比：0分为阳性细胞≤5%；1分为阳性细胞数6%～10%；2分为11%～50%；3分为51%～75%；4分为≥76%。以两类分数乘积进行判断：0分为阴性，1－4分为（＋），5－8分为（＋＋），9－12分以上为（＋＋＋），（＋～＋＋＋）为阳性表达，（＋＋）和（＋＋＋）为强阳性表达。

4．统计分析

采用SPSS17．0统计软件进行分析。FAK、NF－κBp65及VEGF－C在NSCLC癌组织中的表达与患者临床病例特征之间的关系应用χ2检验，三个免疫指标之间的相关性采用Spearman等级相关分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．FAK在NSCLC和癌旁组织中的表达

FAK表达阳性为胞浆内呈棕黄色颗粒（图1A、1B），FAK在NSCLC组织中的阳性表达率为57．3%，显著高于癌旁正常组织的13．3%（表1）。分析FAK与临床病理因素的关系发现，其与NSCLC的分化程度，临床分期及淋巴结转移情况相关，而与其他因素无关（表2）。

2．NF－κBp65蛋白的阳性表达主要位于细胞核及细胞浆（图2A、2B），NF－κBp65在 NSCLC和癌旁正常组织中的阳性表达率分别为85．3%和16．7%，其差异具有统计学意义（P＜0．05）（表1）。NF－κBp65蛋白表达与NSCLC的临床分期、淋巴结转移等显著相关（P＜0．05）（表2）。

3．VEGF－C在NSCLC中的表达主要位于胞浆，阳性表达为棕黄色颗粒（图3A、3B），在癌组织中的阳性表达率为65．3%，而在癌旁组织中表达为阴性（表1）。VEGF－C在NSCLC中高表达与肿瘤的分化程度、临床分期及淋巴结转移密切相关，但与患者性别和组织学类型等无关（表2）。

表1 FAK、NF－κBp65及VEGF－C在NSCLC和癌旁组织的表达Table 1 Expression of FAK、NF－κBp65、VEGF－C in cancerous and adjacent tissues

表2 FAK、NF－κBp65及VEGF－C表达与NSCLC临床病理特征的关系Table 2 The relationship between FAK、NF－κBp65、VEGF－C expression in NSCLC and clinicopathological characteristics

4．FAK、NF－κBp65和 VEGF－C在 NSCLC中表达的相关性

本实验研究发现FAK和NF－κBp65在癌组织中共阳性表达41例，共阴性表达10例，NF－κBp65和VEGF－C共阳性表达43例，共阴性表达10例，两组数据经Spearman相关分析，r值分别为0．228和0．274，P 值均小于0．05，因此 FAK 和 NF－κBp65，NF－κBp65和 VEGF－C之间分别存在正相关关系（表3，表4）。

表3 FAK、NF－κBp65在非小细胞肺癌中表达的相关性Table 3 The relationship between FAK and NF－κBp65in NSCLC

表4 NF－κBp65、VEGF－C在非小细胞肺癌中表达的相关性Table 4 The relationship between FAK and NF－κBp65in NSCLC

讨 论

FAK是1992年由Hanks等从v－src转染的鸡胚成纤维细胞中克隆鉴定出来，因与细胞黏附关系密切，故命名为黏着斑激酶。FAK是一种非受体蛋白酪氨酸激酶，分布于细胞黏着斑部位，是介导细胞与细胞之间，细胞与细胞外基质信号转导的重要的胞内分子，与肿瘤细胞生存、增殖、凋亡、迁移及血管生成等密切相关［3］。已有研究表明，FAK在多种肿瘤中高表达［4－6］。本研究发现，在NSCLC组织中FAK表达的阳性率明显高于正常肺组织（P＜0．05），且与NSCLC分化程度有关，低分化组的阳性率高于高分化组，而肿瘤的分化程度与其侵袭和转移能力密切相关，提示FAK在调节NSCLC的发生发展中扮演着重要角色。与Park等［4］对FAK在胃癌中的表达情况研究结果相似。

NF－κB是一种具有多向性调节作用的真核细胞转录因子，广泛存在于细胞中。NF－κB信号通路不仅具有调控细胞增殖、分化和凋亡等重要生理功能，而且其异常活化与肿瘤的发生发展密切相关，研究证实，在癌细胞的发生及浸润转移的过程中，NF－κB的活性明显增强［7－10］。本研究显示，肺癌组织中NF－κB的阳性表达率明显高于癌旁正常肺组织，且差异有统计学意义（P＜0．05）；说明 NF－κB的高表达与肺癌的发生有关。结果分析显示，NF－κB的表达与NSCLC的分化程度、TNM分期和淋巴结转移密切相关，且癌细胞分化程度越低，分期越高NF－κB表达的阳性率越高。

VEGF－C是第一个被发现的淋巴管生长因子，可与受体VEGFR－3结合，促进淋巴细胞增生，形成新生的淋巴管［11］。肿瘤细胞可以通过表达VEGFC诱导淋巴管生成而促进肿瘤淋巴结转移，已在动物实验及临床研究中得到证实［12］。抑制VEGF－C的表达可以抑制肿瘤淋巴结转移，改善肿瘤治疗预后［13］，进一步证明了VEGF－C在淋巴管生成及肿瘤淋巴转移中的作用。本研究显示VEGF－C蛋白在肺癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织，且VEGF－C蛋白阳性表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移等密切相关。证实非小细胞肺癌癌细胞可以表达、分泌 VEGF－C，与李杰等［14］的研究结论一致。因此，VEGF－C蛋白阳性表达预示着淋巴结转移的可能性，淋巴转移是影响肿瘤患者预后的重要因素。此结果提示，不同分化程度及TNM分期是肿瘤预后不同的原因。

研究证实，FAK可以通过FAK－PI3K信号通路在RAS的参与下激活PI3K，进而通过蛋白激酶B（即PKB）成员AKT磷酸化一系列下游分子如NF－κB，导致bcl－2转录增强［15］。本研究亦得到相似结果。已有研究证实，NF－κB和VEGF在多种肿瘤中的表达存在正相关关系，本研究虽得到与已有研究一致的结论，但仍需要大样本实验研究进一步证实。

综 上 所 述，FAK、NF－κBp65 和 VEGF－C 在NSCLC的发生发展中起着重要作用，且三者的阳性表达与肿瘤的分化程度、TNM分期及淋巴结转移密切相关。因此，联合检测三者在NSCLC组织中的表达，可以作为预测肿瘤恶性程度及预后的指标，为肺癌的诊断和治疗提供新的思路及方法。

图 版 说 明

图1A 免疫组化染色肺腺癌中FAK阳性表达，DAB染色×400

图1B 免疫组化染色FAK在癌旁组织中的表达，DAB染色×400

图2A 免疫组化染色肺鳞癌中NF－κBp65阳性表达，DAB染色×400

图2B 免疫组化染色NF－κBp65在癌旁组织中的表达，DAB染色×400

图3A 免疫组化染色肺腺癌中VEGF－C阳性表达，DAB染色×400

图3B 免疫组化染色VEGF－C在癌旁组织中的表达，DAB染色×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1AFAK positive expression in AC ×400

Fig．1BFAK expression in adjacent Lung tissue×400

Fig．2ANF－κBp65positive expression in SCC×400

Fig．2BNF－κBp65expression in adjacent Lung tissue×400

Fig．3AVEGF－C positive expression in AC×400

Fig．3BVEGF－C expression in adjacent Lung tissue×400

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