microRNA原位杂交技术影响因素的探讨

刘卓琦 杨晓红 肖影群 黄 波 章 萍 杨仙荷黄 昀 王炜东 王蒙蒙 罗达亚＊

（1南昌大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，江西南昌330006；2南昌大学附属感染病医院病理科，江西南昌330002；3南昌大学第二临床医学院2011级，江西南昌330006）

MicroRNA（miRNA，miR）是广泛存在于生物个体的一类非蛋白编码小分子RNA。作为动植物体内的重要调控分子，miRNAs与细胞的基因表达、个体发育、组织分化等一系列生理、病理过程密切相［1，2］关。

因能进行定性、半定量及定位分析，在异质性明显的组织标本中，miRNA 原位杂交（miRNA in－situ hybridization，MISH）技术不仅具有较其他常规miRNA分析方法操作简便、费用低廉等优点，同时，由于miRNA具有不易降解而在石蜡包埋组织中长期稳定存在的特性，使得MISH技术在临床科研中的应用受到越来越多的关注［3，4］。然而，常规MISH操作仍然受到多重因素的影响，包括临床标本的组织来源、保存时间；组织切片的厚度；蛋白酶K的浓度、孵育时间；探针的浓度、孵育时间、特异性；显色方式等。为此，对影响MISH技术操作的诸多因素进行实验探讨，有助于该方法的建立、完善并在科研工作中广泛应用。

材料和方法

1．材料

原位杂交实验中的石蜡组织均来源于南昌大学附属感染病医院病理科。所有石蜡组织均常规4%中性甲醛固定、石蜡包埋，经HE染色证实其病理类型。

2．试剂

U6和miR－375地高辛标记探针及其相关原位杂交检测试剂购自丹麦Exiqon公司，原位杂交封闭液与洗涤液购自美国Roche公司；Trizol RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；miRNA逆转录与PCR引物购自广州市锐博生物科技有限公司；逆转录试剂盒（RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit）购自美国Thermo公司；实时定量PCR试剂盒（SYBR®Premix Ex TaqTM）购自日本Takara公司。

3．原位杂交

原位杂交使用的液体试剂均需用0．1%DEPC水配制。组织切片原位杂交步骤如下：石蜡包埋组织切片后脱蜡，于37℃蛋白酶K消化15min，漂洗后梯度乙醇脱水。55℃恒温预杂交1h后，地高辛标记的miRNA探针55℃恒温杂交1h。碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体室温孵育1h，NBT／BCIP暗处30℃显色。爬片细胞原位杂交步骤如下：培养后的爬片细胞用37℃预温PBS漂洗三次后，4%中性甲醛固定5min。蛋白酶K消化与杂交过程与组织切片一致。NBT／BCIP暗处30℃显色后伊红复染显示细胞基本形态。杂交过程选择U6探针以及用未添加探针的杂交液处理的组织、细胞作为阴性对照。结果判定：U6呈蓝色或蓝紫色颗粒的阳性信号定位于细胞的胞核；miR－375呈蓝色或蓝紫色颗粒的阳性信号定位于细胞胞质和核仁。

4．细胞培养

三株人乳腺癌细胞株BT549、T47D和MDAMB－231均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，三株细胞均选择含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

5．RNA提取、miRNA逆转录与实时定量PCR

RNA提取按照Trizol试剂盒说明书进行。逆转录按照 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行。按照 SYBR® Premix Ex TaqTM的操作说明，以U6为内参照，使用ABI 7500 Fast Real－Time PCR System（Applied Biosystems，美国）进行实时定量PCR扩增反应，每个样品3个重复孔。采用公式2－ΔCt（ΔCt＝ Ct miR－375 – Ct U6）计算miR－375的相对表达量。

结 果

1．不同保存时间和组织来源的石蜡切片U6探针的原位杂交

选择1990－2013年不同时间保存的多个乳腺、肺脏、肝脏组织，分别以未添加探针、添加U6探针的杂交液行原位杂交。结果显示：来源于不同时间保存的三种组织均有U6显色，保存时间越短的组织显色效果越好。其中乳腺组织切片75593与肝脏组织切片5060的U6表达最高，显色最好。以乳腺组织切片75593为例，阴性对照的乳腺腺上皮胞核显红色；U6探针杂交结果为乳腺腺上皮胞核显蓝紫色（图1）。

2．不同厚度组织切片的U6探针的原位杂交

选择U6表达最高的乳腺组织切片75593与肝脏组织切片5060的4μm和6μm切片分别进行原位杂交分析。实验结果显示：组织标本切片越薄，杂交过程中越不易掉片，4μm和6μm厚度的组织切片原位杂交染色未见明显差异（图2）。

3．不同浓度的蛋白酶K对组织切片U6探针原位杂交的影响

分别选择2、20和200μg／ml的蛋白酶K，在37℃孵育乳腺组织切片75593与肝脏组织切片5060后，行U6探针的原位杂交。结果显示，在乳腺组织切片75593中，20μg／ml的蛋白酶K作用组较其他组的原位杂交显色更深，效果最好；在肝脏组织切片5060中，200μg／ml的蛋白酶K作用组的显色最佳（图3）。

4．不同浓度的蛋白酶K对爬片细胞的U6探针原位杂交的影响

分别选择2、20和200μg／ml的蛋白酶K，对乳腺癌MDA－MB－231爬片细胞行U6探针原位杂交。结果显示，20μg／ml与200μg／ml浓度的蛋白酶K，于37℃孵育爬片细胞15min后，大部分细胞均因消化过度而丧失细胞基本形态并脱落；在2μg／ml浓度的蛋白酶K作用后，细胞能保持基本形态并呈现细胞核内特异性蓝紫色显色（图4）。

5．爬片乳腺癌细胞的miR－375探针原位杂交

选择BT－549和T47D两株乳腺癌的爬片细胞行miR－375探针原位杂交检测，结果显示，miR－375主要表达在细胞质与核仁，BT－549的miR－375表达明显低于T47D（图5）。

6．实时定量RT－PCR分析乳腺癌细胞的miR－375表达

实时定量RT－PCR对BT－549和T47D两株乳腺癌细胞miR－205表达分析，结果显示，BT－549的miR－375表达明显低于T47D（图6）。

图6 实时定量RT－PCR分析BT549和T47D乳腺癌细胞的miR－375表达Fig．6Quantitative real－time RT－PCR analysis for miR－375in BT549and T47Dbreast cancer cells

讨 论

定性或定量检测miRNAs表达的分析方法多种多样，从原理上主要分为两大类：基于探针杂交和基于扩增技术的检测方法。Northern blotting是基于探针杂交分析中的经典方法，也是miRNA检测的金标准［5］。然而，尽管经过多次改良，该方法仍无法避免样本需求量大、耗时长、操作繁琐等缺点［6，7］。基于扩增技术的方法中，实时定量PCR法是现阶段使用最为普遍的方法。这种方法的特异性和灵敏性都很高［8］，但与其他基于扩增技术的检测方法一样，该方法存在因PCR扩增后失真miRNA的真实表达信息的缺陷。近年来，miRNA分析中，高通量微阵列芯片（Microarray）和第二代测序技术获得了更多的关注［9－12］。然而，由于高通量检测的成本较高［13］，且由于常规实验室生物信息学数据分析能力的欠缺，两种方法的全面普及尚需时日。由于miRNA在石蜡组织标本中不容易被降解而长期稳定存在，在临床标本的分析中，利用石蜡组织标本进行MISH分析越来越多地受到科研人员的青睐。为此，通过探索MISH技术的各种影响因素，建立并完善具备定性、半定量以及定位信息的MISH方法，对临床组织标本进行分析将为miRNA的研究带来更多的便利。

考虑到影响实验操作的各变量因素之间相互关联（如探针的浓度影响探针的孵育时间）以及实验便利、节约等原则，在初步建立MISH方法后，通过固定操作中的部分次要变量因素（蛋白酶K的孵育时间15min、探针的孵育时间1h、显色方式NBT／BCIP），对其他主要变量因素进行了实验探讨。

临床组织标本是miRNA与人类疾病关联研究中的重要资源。现阶段，医院病理科保存标本多为4%中性甲醛固定的石蜡包埋标本，常规HE染色切片多为5μm厚度切片。为确认MISH方法是否适用于常规切片标本的分析，本文选择不同保存时间段的乳腺、肺脏、肝脏的组织，以未添加探针和添加U6探针的杂交液处理的组织切片作为阴性对照和阳性对照进行U6探针的原位杂交分析。结果显示：1）来源于三种组织的多个标本均有胞核内U6显色，但因U6的表达与分布并不均衡，在不同标本来源的切片中显色程度存在差异；2）来源于1990－2013年保存的石蜡组织标本均能显色，保存时间越短的组织显色效果越好；3）4－6μm厚度的组织切片原位杂交染色未见明显差异。以上结果表明，由于miRNA分子短小，不容易降解，原位杂交操作完全能在常规固定并长期保存的多种组织来源的石蜡标本上操作。

原位杂交操作中最主要的两个变量因素是蛋白酶K与探针的浓度。原位杂交中蛋白酶K的作用是通过部分消化细胞膜和细胞核膜，暴露核酸分子，使得探针能顺利地与胞质、胞核内的核酸分子结合。蛋白酶K最适浓度的选择主要与标本的来源、固定时间以及蛋白酶K的孵育时间有密切的关系。如果消化作用不到位，杂交信号将会减弱；消化作用过度，轻则使得杂交信号因弥散而减弱，重则会造成组织的脱片［14－16］。为此，在此次实验中，分别选择2、20和200μg／ml的蛋白酶K与U6显色最强的乳腺组织切片75593、肝脏组织切片5060以及MDA－MB－231爬片细胞孵育15min后，行U6探针的原位杂交。结果显示，在乳腺组织切片75593中，20μg／ml的蛋白酶K作用组较其他组的原位杂交显色更深，效果最好；在肝脏组织切片5060中，200μg／ml的蛋白酶K作用组的显色最佳。爬片细胞原位杂交实验中，20μg／ml与200μg／ml浓度的蛋白酶K作用组中，大部分细胞均因消化过度而丧失细胞基本形态并脱落；2μg／ml浓度的蛋白酶K作用组中，细胞能保持基本形态并呈现特异性蓝紫色显色。原位杂交中探针浓度的选择主要与探针的长度、标记方式、孵育时间、靶核酸分子的胞内丰度等因素有关。探针浓度过低可能造成杂交信号减弱，探针浓度过高则造成不必要的浪费［17，18］。为此，在探针合成公司推荐的探针使用浓度范围内，此次实验分别选择了低、中、高三个浓度进行了摸索，发现U6与miR－375的原位杂交最适浓度分别为1ng／ml和100ng／ml。以上结果说明，原位杂交中主要变量因素的选择受多种因素的影响，依据标本的组织或细胞来源、标本的固定时间，并参照操作说明分组预实验以确定主要变量因素是非常必要的。

现有研究表明，使用实时定量RT－PCR对组织的miRNA分析结果常常与原位杂交分析结果并不一致［19－24］。造成这种情况的原因，一方面可能是诸如标本来源不同、标本容量较小以及组织标本异质性等因素；另一方面，实时定量RT－PCR过程中的引物，尤其是原位杂交探针的特异性常常被忽略了。考虑到组织的异质性可能造成原位杂交与实时定量RT－PCR的结果存在差异，为验证探针的特异性，在异质性较小的细胞水平上进行操作更为可靠。本次实验中，选择了2株乳腺癌细胞分别进行miR－375的实时定量RT－PCR和爬片细胞原位杂交分析。结果显示，两种分析方法均发现BT－549的miR－375表达明显低于T47D，间接说明miR－375探针的特异性。为此，在细胞水平上，结合实时定量RT－PCR的检测，对杂交探针的特异性进行实验验证是非常必要的。这为后续使用该探针在组织与细胞水平上的原位杂交分析提供了保障。

综上所述，通过前期实验确定各种变量因素而建立并完善的MISH技术，为阐明miRNA的作用机制提供了更为便利的条件。

图 版 说 明

图1 正常乳腺上皮U6探针原位杂交结果（NBT／BCIP显色，核固红复染），1A为阳性，1B为阴性对照

图2 不同厚度的组织切片U6探针原位杂交结果（NBT／BCIP显色，核固红复染），2A为4μm，2B为6μm

图3 肝脏组织5060在不同浓度蛋白酶K作用后的U6原位杂交（NBT／BCIP显色，无复染），3A 为20μg／ml，3B为200μg／ml

图4 2μg／ml蛋白酶K作用 MDA－MB－231乳腺癌爬片细胞的U6探针原位杂交（NBT／BCIP显色，伊红复染），4A为×100，4B为×200

图5 BT549和T47D乳腺癌爬片细胞miR－375探针原位杂交（×100，NBT／BCIP 显 色，核 固 红 复 染），5A 为BT549，5B为 T47D

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1In situ hybridization analysis for negative（1A），U6（1B）in breast tissue 75593slices（NBT／BCIP solution，Nuclear Fast Red counterstaining）

Fig．2In situ hybridization analysis for U6in breast tissue 75593slices of different slice thickness （NBT／BCIP solution，Nuclear Fast Red counterstaining）．2A：4 μm，2B：6μm

Fig．3In situ hybridization analysis for U6in different concentration proteinase K treated liver tissue 5060slices（×100，NBT／BCIP solution，without counterstaining）．3A：20μg／ml，3B：200μg／ml

Fig．4In situ hybridization analysis for U6in 2μg／ml proteinase K treated MDA－MB－231breast cancer cell’s climbing slices （NBT／BCIP solution，Eosin counterstaining）．4A：×100，4B：×200

Fig．5In situ hybridization analysis for miR－375in BT549（5A）and T47D（5B）breast cancer cells’climbing slices（×100，NBT／BCIP solution，Nuclear Fast Red counterstaining）

［1］Wang J，Huang SK，Zhao M，et al．Identification of a Circulating MicroRNA Signature for Colorectal Cancer Detection．PloS one，2014，9（4）：doi：10．1371／journal．pone．0087451

［2］Gravgaard KH，Lyng MB，Laenkholm AV，et al．The miRNA－200family and miRNA－9exhibit differential expression in primary versus corresponding metastatic tissue in breast cancer．Breast Cancer Res Treat，2012，134：207－217

［3］Bojmar L，Karlsson E，Ellegard S，et al．The role of microRNA－200in progression of human colorectal and breast cancer．PloS one ，2013，8（12）：doi：10．1371／journal．pone．0084815

［4］Hanna JA，Hahn L，Agarwal S，et al．In situ measurement of miR－205in malignant melanoma tissue supports its role as a tumor suppressor microRNA．Lab Invest，2012，92（10）：1390－1397

［5］Pall GS，Codony－Servat C，Byrne J，et al．Carbodiimide－mediated cross－linking of RNA to nylon membranes improves the detection of siRNA，miRNA and piRNA by northern blot．Nucleic Acids Res，2007，35（8）：e60

［6］Várallyay E，Burgyán J，Havelda Z．Detection of microRNAs by Northern blot analyses using LNA probes．Methods，2007，43（2）：140－145

［7］V~Arallyay E，Burgy~A¡n J，Havelda Z．MicroRNA detection by northern blotting using locked nucleic acid probes．Nature Protocols，2008，3（2）：190－196

［8］Chen C，Ridzon DA，Broomer AJ，et al．Real－time quantification of microRNAs by stem－loop RT－PCR．Nucleic Acids Res，2005，33（20）：e179

［9］Liu CG，Calin GA，Meloon B，et al．An oligonucleotide microchip for genome－wide microRNA profiling in human and mouse tissues．Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（26）：9740－9744

［10］Castoldi M，Schmidt S，Benes V，et al．miChip：an array－based method for microRNA expression profiling using locked nucleic acid capture probes．CORD Confer－ence Proceedings，2008，3（2）：321－329

［11］Grundhoff A，Sullivan CS，Ganem D．A combined computational and microarray－based approach identifies novel microRNAs encoded by human gamma－herpesviruses．RNA，2006，12（5）：733－750

［12］Beuvink I，Kolb FA，Budach W，et al．A novel microarray approach reveals new tissue－specific signatures of known and predicted mammalian microRNAs．Nucleic Acids Res，2007，35（7）：e52

［13］Hansen TB，Bramsen JB，Kjems J．Re－inspection of small RNA sequence datasets reveals several novel human miRNA genes．CORD Conference Proceedings，2010，5（6）：e10961

［14］Amidzadeh Z，Behbahani AB，Erfani N，et al．Assessment of different permeabilization methods of minimizing damage to the adherent cells for detection of intracellular RNA by flow cytometry．Avicenna J Med Biotech，2014，6（1）：38－46

［15］Mostegl MM，Richter B，Dinhopl N，et al．Influence of prolonged formalin fixation of tissue samples on the sensitivity of chromogenic in situ hybridization．J Vet Diagn Invest，2011，23（6）：1212－1216

［16］Shinozaki M，Okubo Y，Nakayama H，et al．Application of in situ hybridization to tissue sections for identification of molds causing invasive fungal infection．Jpn J Med Mycol，2009，50（2）：75－83

［17］Renwick N，Cekan P，Masry PA，et al．Multicolor microRNA FISH effectively differentiates tumor types．The Journal of Clinical Investigation，2013，123（6）：2694－2702

［18］Li J，Li X，Li Y，et al．Cell－specific detection of miR－375downregulation for predicting the prognosis of esophageal squamous cell carcinoma by miRNA in situ hybridization．PloS one，2013，8（1）：doi：10．1371／journal．pone．0053582

［19］Aglawe SB，Fakrudin B，Patole CB，et al．Quantitative RT－PCR analysis of 20transcription factor genes of MADS，ARF，HAP2，MBF and HB families in moisture stressed shoot and root tissues of sorghum．Physiol Mol Biol Plants，2012，18（4）：287－300

［20］Rosa FE，Silveira SM，Silveira CG，et al．Quantitative real－time RT－PCR and chromogenic in situ hybridization：precise methods to detect HER－2status in breast carcinoma．BMC Cancer，2009，9：90－102

［21］Lin C，Huang F，Zhang YJ，et al．Roles of MiR－101 and its target gene Cox－2in early diagnosis of cervical cancer in Uygur women．Asian Pac Journal Cancer Prev，2014，15（1）：45－48

［22］Dontula R，Dinasarapu A，Chetty C，et al．MicroRNA 203Modulates Glioma Cell Migration via Robo1／ERK／MMP－9Signaling．Genes ＆ Cancer ，2013，4（7－8）：285－296

［23］Pazhoomand R，Keyhani E，Banan M，et al．Detection of HER2status in breast cancer：comparison of current methods with MLPA and real－time RT－PCR．Asian Pac Journal Cancer Prev，2013，14（12）：7621－7628

［24］Cai H，Lin L，Cai H，et al．Combined microRNA－340 and ROCK1mRNA profiling predicts tumor progression and prognosis in pediatric osteosarcoma．Int J Mol Sci，2014，15：560－573