1 H-MRS 中Cho/Lip 评价肝细胞肝癌血管生成的价值

姚 瑶 郑 凯 赵振华 王伯胤

肝细胞肝癌(HCC)的发生、发展、浸润、转移、复发与预后均与其新生血管的形成密切相关。目前公认与肿瘤血管生成紧密相关的是微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)。肿瘤新生血管的结构和功能都不同于正常血管，导致肿瘤的血供异常从而影响肿瘤细胞的物质代谢。本研究的目的在于探讨HCC 血管生成与肿瘤细胞代谢物的关系，以及运用1H-MRS 来预测肿瘤血管生成情况，为指导临床治疗提供依据及评估预后情况。

材料与方法

1.一般资料:对2012 年6 月～2013 年9 月临床拟诊为HCC 的病例进行前瞻性研究，每个受试者行肝脏常规MRI及1H-MRS，所有病例严格执行MRI 检查的适应证及禁忌证，检查前未行任何治疗，病灶最大直径均≥2cm。剔除谱线质量较差的病例后得到经病理学证实为HCC 的57 例1H -MRS 谱线，选取癌旁肝组织1H-MRS 谱线做对照。其中13 例行免疫组化检测MVD 及VEGF 表达。本研究经绍兴市人民医院医学伦理委员会批准(2011017)，且取得患者知情同意书。

2.常规MRI 检查方法:使用西门子3.0T 超导型磁共振扫描仪(Verio，德国Siemens 公司)，12 通道相控阵表面线圈检查。检查前训练患者呼吸，必要时嘱患者吸气末屏气。常规平扫序列包括:快速扰相梯度回波(FLASH)T1WI(同反相位)，快速自旋回波(TSE)脂肪抑制T2WI。采取双盲法由两名放射科诊断医师对所得MRI 图像进行诊断分析，并给出个人诊断，当两人诊断意见不一致时经商讨后得出诊断结果。

3.1H-MRS 检查方法和数据分析:1H-MRS 检查选用单体素点解析波谱(point -resolved spectroscopy，PRESS)序列:TR2000ms、TE30ms、反转角90°、激励次数(NEX)为80 次，时间为3 ～5min。体素大小为2cm ×2cm ×2cm。采集前先进行自动预扫描，之后以T2WI 图像作为1H -MRS 定位。将体素置于所采集图像肿瘤兴趣区(region of interest，ROI)范围内，避开肿瘤囊变、出血及坏死区域，肝组织内体素的放置远离肝脏边缘10mm 以上，并避开大的血管及肝内胆管。检查前禁食4h 以上，采用呼吸导航技术来避免呼吸运动伪影及体素的移位，当运动较规律且幅度小时，可加大信号采集次数，增加波谱SNR［1，2］。扫描完成后，将波谱数据传输至西门子工作站进行后处理，记录每个受试者Cho 峰及Lip 峰的峰下面积和Cho/Lip 峰下面积比。

4.免疫组化检测MVD 及VEGF 表达:13 例穿刺或手术切除取得的HCC 组织标本，尽量与MRS 所取ROI 相同，全部石蜡标本均行2.5μm 连续切片，采用标准的avidin - biotin -peroxidase 病理技术检测其VEGF、CD34 表达情况。每组实验均设立阴性对照。免疫组化结果判读:(1)VEGF 特异性抗体的免疫染色结果采用IRS 的方法进行半定量测定，IRS 的具体计算方法如下:染色强度(SI)分级:0 分:不显色;1 分:浅黄色;2 分:棕黄色;3 分:深棕色;染色细胞的百分数(PP):0分:不显色;1 分:染色细胞≤10%;2 分:染色细胞11% ～50%;3 分:染色细胞51% ～80%;4 分:染色细胞≥81%，IRS= SI×PP。(2)MVD 测定采用Weidner［3］技术，先在低倍镜(×40)视野下找到“热点(hot spot)”，然后在高倍镜(×200)视野下任选不重复的5 个视野，计算全部横切和纵切的阳性血管数，取平均值作为该病例的MVD 值。以上均请两位病理科医生分别进行评估，采取双盲法，然后相互交换切片，当两人意见不一致时经商讨后得出结果。

结 果

1.Cho/Lip 峰下面积比在HCC 病灶组与对照组的差异:列入统计的57 例HCC 病灶组及对照组谱线均基线平稳、信噪比高及主要波峰可辨认，在3.2μg/L 和1.3μg/L 处分别可见高耸的Cho 峰和Lip 峰(图1)。病灶组Cho/Lip 峰下面积比为0.322±0.475，对照组的Cho/Lip 峰下面积比为0.238 ±0.529，病灶组明显高于对照组，两组间比较差异有统计学意义(P ＜0.05)。

图1 HCC 患者癌旁肝组织及HCC 病灶的1H-MRS 谱线

2.HCC 病灶免疫组化检测结果:所有病例均经病理学证实，其中32 例为穿刺活检，其取材较少无法行免疫组化检查，另有12 例为外院病理学证实，其标本无法获取;其余13 例为笔者医院手术切除或穿刺取材较多的病例，对其进行HE 染色和免疫组化检查(图2)。CD34 在HCC 病灶中呈阳性表达，阳性染色局限于血管内皮细胞的胞膜和胞质，形成条状或环状，呈弥漫分布。本组13 例HCC 病灶MVD 值为46 ～172，平均MVD 值为86。VEGF 的阳性表达见于HCC 细胞膜和胞质，呈灶性分布。按照IRS 的值分为0 ～12 总共13 个等级，平均IRS 为5。对HCC 组织的MVD 与VEGF 的表达进行相关性分析，两者间相关性不具有统计学意义(P=0.340，图3)。

图2 HCC 患者的免疫组化检查结果

图3 13 例HCC 组织的MVD 与VEGF 表达的关系

3.Cho/Lip 峰下面积比和MVD、VEGF 表达的关系:经分析13 例HCC 组织的MVD 随着Cho/Lip 峰下面积比值的增加而增加，二者之间呈正相关(r =0.719，P = 0. 006，图4)。但分析其VEGF 表达与Cho/Lip 峰下面积比的关系，结果显示相关性不具有统计学意义(P=0.523，P=0.065，图5)。

图4 经Pearson 分析13 例HCC 组织MVD 与Cho/Lip 峰下面积比的关系

图5 经Spearman 分析13 例HCC 组织VEGF 表达与Cho/Lip 峰下面积比的关系

讨 论

1.1H-MRS 各代谢物水平在HCC 中的意义:1H-MRS 能观察肿瘤能量代谢、糖代谢、氨基酸和脂肪酸等有关的代谢物，使对肝脏肿瘤的影像学认识深入到微观功能和生化水平。本研究采用代谢物半定量分析方法，主要观察Cho 峰及Lip 峰的变化，得到它们的峰下面积，然后计算Cho/Lip 峰下面积比。

脂质峰群，包括甲基峰(Lip1，0.9μg/L)、亚甲基峰(Lip2，1.3μg/L)和邻近羧基及烯属基团的亚甲基峰(Lip3 和Lip4，2.0 及2.8μg/L)，而Lip2 峰是脂质峰群中恒定出现、含量最高且易于检测的代谢物峰，因此备受研究者关注，且常用作1H -MRS 肝脏检查的内部参照代谢物［4］。Cho 峰位于3.2μg/L 处，是细胞膜磷脂代谢的成分之一。HCC 由于细胞增殖活跃和有丝分裂增加导致细胞膜转换增加，Cho 峰常明显升高［5，6］。Inglese 等［7］研究表明Cho 含量有助于评估肿瘤细胞的恶性程度，且随着肿瘤恶性程度的增加而增加。本研究采用半定量分析Cho/Lip 峰下面积比，结果显示病灶组Cho/Lip 峰下面积比高于对照组(n=57)，且差异有统计学意义(P ＜0. 05)。Kuo等［8］对1H-MRS 活体肝脏肿瘤的研究和董爱生等［9］研究均表明，相对于正常肝脏组织，HCC 的Cho/Lip比值升高，与本研究结果一致。

2.HCC 肿瘤血管生成的意义:血管生成(angiogenesis)是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管。正常人的血管生成被严格控制在某些特定的生理过程中，如生殖、发育和创口愈合等;而持续、失控的血管生成则是某些病理改变如肿瘤生长的特征。肿瘤血管形成后不仅为其供应营养物质，使肿瘤细胞不可抑制地生长、增殖，而且新生血管多为幼稚血管，管壁仅为一层内皮细胞，缺乏平滑肌细胞的阻挡，这为其浸润、转移提供了有利的条件［10］。HCC 是富血供肿瘤，且HCC 的血管生成与其生物学行为密切相关，因此定量分析HCC 血管生成至关重要。研究表明MVD 是目前评价肿瘤血管生成的金标准，目前临床上也多采用此方法［11］。HCC 中CD34 标记的血管非常丰富，因此本研究亦采用此方法。

参与调节肿瘤血管生成的因子很多，其中VEGF被认为是作用于血管内皮细胞，促进血管生成，特异性最高、功能最强的调控因子。有研究显示HCC 中VEGF 阳性和阴性者MVD 值差异有统计学意义，提示VEGF 与MVD 值呈正相关。本研究分析13 例HCC 病灶MDV 值和VEGF 表达的关系，结果显示MVD 与VEGF 表达的相关性不具有统计学意义(P ＞0.05)，与之前查阅文献不一致。分析其原因，一方面是本研究行免疫组化检查的病例数过少，另一方面是VEGF 虽是作用最强、特异性最高的血管生成调控因子，但肿瘤血管生成还受其他生成因子如黏附因子等的影响，且此过程还受血管抑制素等抑制因子的影响。另外定量分析HCC 血管生成的金标准是MVD，但肿瘤的血管生成还与其血管面积、直径、成熟情况等有关。

3.Cho/Lip 峰下面积比与肿瘤血管生成的关系:HCC 的生长依赖于新生血管，较多研究已证明MVD及VEGF 表达与HCC 的发生发展、浸润转移、复发与预后密切相关。国内已有研究表明，31P -MRS 检测HCC 各代谢物的变化与血管生成具有一定的关系，且肿瘤血管生成的异质性会影响细胞的代谢和31P -MRS 的检测结果，但两者之间的关系还需进一步验证［12，14］。Kuo 等［8］报道肿瘤内Cho/Lip 比对于鉴别肝脏良、恶性肿瘤有一定的临床价值，恶性肿瘤的Cho/Lip 大于良性肿瘤。

本研究首次对HCC 病灶中同一区域内部的MVD 与Cho/Lip 峰下面积比的相关性进行研究，发现HCC 中MVD 与Cho/Lip 峰下面积比呈正相关(r=0.719，P=0.006)，这提示HCC 的MVD 可能与肿瘤的细胞代谢有一定关系。Lip 峰易于检测且恒定出现，常用作1H -MRS 肝脏检查的内部参照代谢物，Cho 峰反映了细胞膜新陈代谢的水平，在生长迅速的肿瘤组织中Cho 峰常升高［8］。MVD 反映了局部组织的血供情况，由于肿瘤生长对血供的依赖，在肿瘤内会诱导生成大量的新生毛细血管［14，15］。

上述3 点反映了肿瘤组织的代谢水平及生长情况，亦解释了MVD 与Cho/Lip 峰下面积比呈正相关，临床工作中可以用Cho/Lip 峰下面积比间接地评估HCC 病灶的MVD。另外，本研究还分析了VEGF 表达与Cho/Lip 峰下面积比的关系，结果显示差异不具有统计学意义。原因在于病例过少和取材，无法保证所取组织层面与1H -MRS 所取兴趣区完全一致，有可能所取组织层面不在1H -MRS 检测的层面，还有部分病例仅用穿刺活检组织进行免疫组化测定，会造成结果有一定的差异。VEGF 虽是作用最强、特异性最高的血管生成调控因子，但并不是血管生成的唯一因素，血管生成还受其他诸多因素的影响，还需要进一步研究。

总之，HCC 病灶组Cho/Lip 峰下面积比与对照组比较差异有统计学意义，说明肝脏1H -MRS 技术对于HCC 的诊断有较高的临床应用价值。1H -MRS 检测HCC 病灶的Cho/Lip 峰下面积比与肿瘤组织MVD呈正相关，测定Cho/Lip 峰下面积比对预测HCC 肿瘤组织血管生成具有重要的临床价值，1H -MRS 为动态监测肿瘤血管生成及抗肿瘤血管生成药物疗效的评价提供一种潜在、无创、重复性好的影像学检查方法，同时还能通过测定肿瘤组织MVD 间接地反映肿瘤细胞的代谢能力。

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