17β-雌二醇作为扩充液对大隐静脉保护作用的研究

殷 巍 王 亮 张丽晶 员建平

冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass graft，CABG)是目前国际公认的最有效的治疗冠心病方法之一，在冠状动脉旁路移植术中，自体大隐静脉因其解剖位置表浅，易于游离，取材方便且有足够的长度，能够方便地使病变冠状动脉远端的血管与主动脉或其分支连接等优点仍然是目前最常用的桥血管替代材料之一。然而，桥血管内皮细胞的损伤从一开始离取、扩张和保存血管时就已经开始，静脉桥的损伤导致术后再狭窄和闭塞严重影响了其远期的通畅率，最常见的损伤因素是切取大隐静脉时通常因为各种原因引起痉挛，操作导致的机械与压力刺激，引起血管平滑肌局部释放化学痉挛因子［1，2］。如何提高术后近、远期通畅率和生存率是当今冠脉外科领域的研究难题之一。本课题从CABG 桥血管扩充液的方面进行研究，目前在国内外还未见有对17β -雌二醇(E2)作为扩充液的报道，而17β-雌二醇在扩血管和防止搭桥术后桥血管再狭窄方面及促心肌血管生成作用的研究已经得到了证实［3～8］。本课题为其能否作为新型扩充液，减轻桥血管VEC 的损伤提供理论依据。

材料与方法

1.临床资料:(1)研究对象:筛选21 例就诊于包头市中心医院(2010 年10 月～2011 年11 月)行冠状动脉旁路移植术(CABG)的患者，取其冠状动脉旁路移植术后剩余的大隐静脉。(2)入选标准:所有患者行CABG 术前均通过下肢血管超声检查显示均无大隐静脉桥曲张损害和其他损害。

2.方法:本研究分两个阶段进行。第1 阶段:筛选21 例行CABG 的患者(考虑到人为取血管手术技术不同的对血管损伤因素，本实验21 例血管均为同一人员所取)取术前未进行扩充的大隐静脉，留下进行冠状动脉旁路移植剩余的血管分割成3 段，每段长约2cm 分为3 组，A 组17β - 雌二醇组(n=21);B 组婴粟碱组(n=21)和C 组自体血液肝素混合组(n=21)，各组用不同的扩充液扩充进行比较。试验各组取相同扩张压力1000mmHg 扩张桥血管，扩充时通过静脉延长管中扩张液形成的小液柱推动前端密闭腔中形成的气体传导压力(整个过程中装置处于同一水平面，并且保证严格无菌操作)压力表及注射器采用冠状动脉球囊扩张所用上海产压力注射器一体，扩充后的血管按要求分别保存在10%甲醛及3%进口戊二醛中，并存放在4℃冰箱保存。扩压表每次用完一组扩充液后用生理盐水冲洗3 遍，用完后用医院高温压力锅消毒，整个过程严格保持无菌超作。第2 阶段:①扩张后将大隐静脉各切取1cm 经石蜡包埋切片后经HE 染色和扫描电镜样品制备后，并用光镜和扫描电镜观察单位面积血管内皮细胞(VEC)的死亡数目及细胞器的损伤情况［9］;②取1cm免疫组化标记后用光镜观察血管内皮细胞(VEC)细胞间黏附分子-1(ICAM-1)来比较各组扩张液血管的损伤情况;③比较3 组扩张液扩张后大隐静脉内膜VEC 的死亡，以及中膜血管平滑肌的撕裂，通过各组的比较得出对大隐静脉离取后应用扩张液对血管内膜损伤最小组，在具体的临床应用上能提高大隐静脉桥的远期通畅。

3.观察血管损害的分级标准:(1)光镜:按内皮细胞脱落的程度分为4 级:每高倍镜视野下大隐静脉固有膜表面内皮细胞所占比例＞75%为1 级，50% ～75%为2 级，25% ～50%为3 级，＜25%为4 级［10］。(2)透射电子显微镜:取3 组切片标本，在电子显微镜视野下找出能观察到的内皮细胞和平滑肌细胞数进行统计学分析，应用日本HITACHZ H-700H 电子显微镜参照细胞损伤程度分级标准对其超微结构损伤程度进行分级［9］(表1)。(3)免疫组化法:检测血管内皮细胞(VEC)细胞间黏附分子-1(ICAM -1)的比较来观察各组应用扩张液血管前后的情况。13 点评分法是以0 ～4 分来判定阳性细胞的百分比:0 分，没有阳性细胞;1 分，阳性细胞百分比＜10%;2 分，阳性细胞百分比＞10%但＜50%;3 分，阳性细胞百分比＞50%但＜80%;4 分，阳性细胞百分比＞80%。染色强度按阴性、弱、中、强染色分别评为0 ～3 分(染成棕黄色为阳性细胞)。最终的评分是指标的乘积［11］。

表1 细胞损伤程度分级标准

结 果

应用17β -雌二醇和罂粟碱组作为扩充液扩充后的血管通过光镜观察药物扩张后的大隐静脉内皮细胞脱落较少，1 ～2 级占95%，管壁固有膜，肌层细胞排列整齐，细胞变性较少(表2，图1)。而自体血肝素混合组作为扩充液扩充后的大隐静脉内皮细胞大量脱落，Ⅱ～Ⅲ级占90%，固有膜细胞水肿明显，肌层细胞出现黏液变性及肌纤维变性(表2，图1)。血管免疫组化及电镜结果观察损伤最小，经统计学处理，各组损伤分级差异有统计学意义(P ＜0.05)。应用17β-雌二醇和罂粟碱组作为扩充液扩充后的血管通过透射电镜观察药物扩张后的大隐静脉内皮细胞和平滑肌细胞超微结构各细胞器较为清晰、完整，按照细胞超微分级标准Ⅱ～Ⅲ级占70%以上，而自体血肝素混合组作为扩充液扩充后的大隐静脉内皮细胞损害、自溶现象较多，超微结构各细胞器模糊不清有的甚至消失，分级标准Ⅲ～Ⅳ级占70%以上(表3、表4，图2、图3)。

表2 光镜结果

图1 HE 染色实验照片(×200)

表3 内皮细胞电镜结果数量统计(n)

表4 平滑肌细胞电镜结果数量统计(n)

图2 免疫组化实验照片(×100)

图3 内皮细胞透射电子显微镜照片(×15000)

应用17β-雌二醇组作为扩充液扩充后的血管通过免疫组化(ICAM-1)检测观察阳性表达最少，按国际上通用13 点评分标准基本在1 分，而自体血肝素混合组作为扩充液扩充后的血管通过免疫组化(ICAM-1)检测观察阳性表达最多，按国际上通用13 点评分标准基本在6 分(表5，图4)。

表5 免疫组化(ICAM-1)

讨 论

图4 平滑肌细胞透射电子显微镜照片(×15000)

CABG 手术目前仍是治疗冠心病最主要的方法之一。然而，术后桥血管的再狭窄仍是当今困扰全世界心脏外科的一大难题。如何提高术后远期通畅率和生存率是当今冠脉外科领域的研究难题之一。桥血管离取过程中的过分牵拉，过高的扩张压力将直接导致血管内皮细胞的脱落，甚至中膜血管平滑肌的撕裂。为了防止高压扩张血管后所带来的损害，目前国内外在取完桥血管后常打入的扩充液主要为婴粟碱液，进行实验研究的有硝酸甘油- 维拉帕米液等［10～13］。Liu 等［14］研究指出，扩张时生理所能承受的压力范围可能为100 ～600mmHg。本课题从CABG桥血管扩充液的方面进行研究，为寻求新型扩充液，减轻桥血管VEC 的损伤，提高CABG 术后桥血管远期的通畅率提供理论依据。实验前也通过预实验得出相同结论，扩张压力＜1000mmHg 时，血管的损伤较小，不容易比较血管的损伤的情况，因此本实验扩充血管的扩张压力选择1000mmHg。

通过本研究光镜结果表明，应用17β -雌二醇为扩充液的大隐静脉内皮细胞损伤最小，罂粟碱组次之，自体血肝素混合组损伤最大，其原因为17β -雌二醇和罂粟碱组在扩充血管时通过其舒血管的机制，有效的防止了大隐静脉的痉挛，使血管壁平滑肌舒张使整个血管均匀性扩张，静脉管壁具有弹性，质地较韧，内皮细胞脱落较少，肌层细胞排列整齐，细胞变性较少。17β-雌二醇组优于罂粟碱组其原因可能为17β-雌二醇存在扩血管的机制多于罂粟碱:17β -雌二醇从基因组和非基因组均存在舒血管机制，具体如下:①雌激素从基因组开始阻碍腺苷酸环化酶(cAMP)或鸟苷酸环化酶(cGMP)的激活，减少其的缩血管的机制进而达到其舒血管的目的;②非基因组舒血管机制通过内皮依赖和非内皮依赖发挥其作用。当17β-雌二醇浓度为10-9～10-6mol/L 时，其通过内皮型促进一氧化氮合酶(eNOS)等作用激活鸟甘酸环化酶(GC)，增加细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)等机制，进而激活蛋白激酶G(PKG)及K+通道的开放，最终达到舒张血管平滑肌的作用;当17β -雌二醇浓度＞10-5mol/L 时，其舒血管作用通过非内皮依赖，其机制是阻断血管平滑肌细胞膜上两种钙通道进而阻断所有类型的钾离子通道达到舒血管目的。而传统罂粟碱舒血管机制少于雌激素，且罂粟碱液对血管存在多种不利因素:①罂粟碱溶液损伤血管内皮超极化因子(EDHF)介导的内皮依赖性舒张，增加了血管的张力;②其酸性pH 值(pH 5. 0)，会进一步损伤VEC 可引起抗血小板聚集，笔者实验观察到对血管的扩充及保护作用不如17β -雌二醇组。而自体血肝素混合组扩充血管为纯暴力克服大隐静脉痉挛，引起血管平滑肌局部释放化学痉挛因子，内皮细胞大量脱落，内皮脱落，固有层细胞水肿明显，肌层细胞出现黏液变性及肌纤维变性，通过笔者的实验观察血管损伤最大，这一点与国内外其他研究一致。

通过本研究透射点镜观察结果表明，应用17β -雌二醇作为扩充液扩充后的血管通过透射电镜观察药物扩张后的大隐静脉内皮细胞和平滑肌细胞超微结构各细胞器较为清晰、完整，罂粟碱组次之，自体血肝素混合组损伤最大。其原因除了17β -雌二醇上述舒血管机制减少细胞损伤外，还可能与雌激素通过诱导凋亡抑制基因bcl -2mRNA 表达，进而增加bcl-2 蛋白合成，诱导c-myc 编码的蛋白质，抑制平滑肌增殖发生凋亡，笔者的实验观察到17β -雌二醇组细胞超微结构各细胞器较为清晰、完整。本实验的电镜结果显示，酸性罂粟碱溶液损伤血管内皮细胞及血管内皮超微结构与文献报道是一致的。另外通过本实验发现利用透射电镜结合对血管内皮细胞的超微结构展开研究，具有准确、直观，既可定量又可定性研究的优点。

本实验本实验结果中发现，17β -雌二醇组作为扩充液扩充后的血管通过免疫组化(ICAM -1)检测观察阳性表达最少，ICAM -1 是目前认识的黏附分子主要有细胞间黏附分子-1，在多种血管性疾病病理变化，如炎症有关的疾病、血管损伤性疾病以及缺血再灌注性损伤等多种病理条件下，皆可发生中性粒细胞与内皮细胞的黏附，其黏附正是由细胞表面的ICAM-1 等黏附分子介导的，且ICAM -1 在白细胞对内皮的紧密黏附中起关键作用，二者的结合导致中性粒细胞与内皮细胞黏附，成为内皮细胞损伤和功能障碍的基础。中性粒细胞及内皮细胞在病理条件下，还可以释放一些细胞因子，如TNF -α、IL -1 等，由此引起缺血后的炎症反应。同时这些炎症细胞因子又可以增加内皮细胞、中性粒细胞表面黏附分子的表达，促进二者的黏附，加重内皮细胞损伤。黏附的中性粒细胞还可以通过释放一些弹性蛋白酶来损伤内皮细胞，同时，中性粒细胞的活化和穿入会引起组织的炎性损伤，会导致组织的重构。本实验可以得出17β-雌二醇作为扩充液组血管ICAM -1 阳性表达最少，可以得到其对血管损伤最小，推测扩充液从理论上应增加桥血管远期通畅性。

本课题应用17 -β 雌二醇作为扩充液与传统扩充液在相同扩充压力下对静脉桥损伤的对应比较，结果发现在临床中选取17 -β 雌二醇作为扩充液对大隐静脉损伤最小，为其应用在临床冠状动脉旁路移植术中提供了理论依据，但其在临床工作中保持桥血管通畅性的效果还需要临床试验进行论证及进一步研究。

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