肝内胆管细胞型肝癌中HLA-F 的表达及临床意义

徐永富 方哲平 陈 霞 潘君芬 陈思思 蒋琼英

肝内胆管细胞型肝癌(intraheptic cholangiocarcinoma，ICC)是一种源于肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，约占原发性肝癌的5% ～15%，其恶性程度高，预后差，手术切除率远比肝细胞癌要低［1，2］。随着对肿瘤研究的深入，发现人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)与肿瘤的发生、发展密切相关，HLA-Ⅰ类分子表达下调可使肿瘤细胞逃避细胞毒性T 细胞的免疫识别，而非经典HLA - Ⅰ类分子(HLA-E、G、F)作为免疫耐受分子，亦可帮助肿瘤细胞逃避机体免疫细胞(NK 细胞、T 细胞等)的识别与杀伤［3，4］。HLA-F 是新近发现的第3 种非经典HLA-Ⅰ类分子，其基因多态性(HLA -F* 01:04)与肝癌的易感性有关，HLA-F 抗体存在于各种肿瘤患者(包括肝癌)的血清中，而且证实在肺、食管、胃等多部位肿瘤组织中存在HLA-F 异常表达［5～9］。

目前，国内外尚未见到HLA-F 与ICC 的相关性报道，本研究中笔者利用免疫组化法检测ICC 组织中HLA-F 的表达情况，并分析其与临床病理因素的相关性，探讨HLA-F 与ICC 发生、发展的内在关系。

材料与方法

1.标本来源:收集2003 年1 月～2012 年5 月在温州医科大学附属浙江省台州医院接受手术治疗的75 位ICC 患者的组织标本(75 例ICC 癌灶组织及51 例邻近正常组织)，术后均确诊为肝内胆管细胞型肝癌。肿瘤病理诊断参照世界卫生组织标准、临床分期标准参照美国癌症联合委员会(AJCC)制定的第七版TNM 分期标准［10］。术前患者均未接受放化疗或其他任何药物干预。并有完整临床病理资料(年龄、性别、病理诊断、被膜累及情况、血管/淋巴管浸润情况、肿瘤直径、肿块数目、TNM 分期等)。所有人体标本的研究均事先获得伦理委员会的批准。

2.免疫组织化学染色:石蜡包埋组织按照4μm 厚度进行连续切片，所得石蜡切片常规脱蜡、梯度乙醇水化;3%H2O2孵育15min，消除内源性过氧化物酶活性;高压锅热处理5 ～8min 进行抗原修复;山羊血清孵育15min，消除非特异性抗体;滴加按照1∶300 稀释后的兔抗人HLA -F 抗体14670 -1-AP(proteintec group，Chicago，IL，USA)，湿盒内4℃孵育过夜;滴加山羊抗兔抗体(二抗，Dako，Glostrup，Denmark)，室温孵育1h，PBS 冲洗;浓缩型DAB 显微镜下控制显色;苏木精复染，脱水，中性树脂封片。皮肤癌组织用于阳性对照，以PBS替代HLA-F 抗体作为阴性对照。

3.HLA-F 表达结果判定:阳性细胞表现为细胞膜或细胞质出现棕色或棕褐色颗粒，由2 名病理医师进行独立双盲半定量评估，取其平均值作为最终结果。切片内染色阳性细胞数占全部细胞5%以上标记为HLA-F 表达阳性，反之记为阴性。

4.统计学方法:采用SPSS 13.0 统计软件，HLA -F 在癌灶组织和正常组织差异表达，以及其与各临床病理因素的关系分析均采用Pearson χ2检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.HLA-F 在ICC 癌灶组织中异常高表达:细胞膜或细胞质出现棕色或棕褐色染色产物定位为HLA-F 阳性细胞，皮肤癌组织作为阳性对照，以PBS 代替HLA-F 抗体作为阴性对照(图1)。在肝癌癌灶组织中表达阳性率为38.7%(29/75)，而邻近正常组织不表达HLA-F(0/51)，差异有统计学意义(χ2=25.616，P ＜0.05)，癌灶组织HLA-F 表达升高。

图1 免疫组织化学染色检测HLA-F 表达

2.肝癌中HLA-F 的表达量与临床病理参数的关系:为研究HLA-F 的临床相关性，笔者分析了肝癌癌灶区HLA-F 表达量与各临床病理因素的关系。数据显示HLA - F 表达与肿瘤数目(χ2= 4.723，P =0.030)、血管/淋巴管浸润情况(χ2=5.476，P=0.019)相关，而与患者性别、年龄、被膜累及情况、肿瘤直径、TNM 分期等无明显相关。HLA-F 表达更多见于肿瘤多发或伴有血管/淋巴管浸润的ICC 患者(表1)。

讨 论

本次实验发现，38.7%ICC 癌灶组织表达HLAF，而邻近正常组织均无HLA-F 表达，差异有统计学意义，HLA-F 在癌灶组织中表达升高。进一步统计分析发现，癌灶区HLA-F 表达量和肿瘤数目、血管/淋巴管浸润等相关;笔者由此推测，HLA -F 在ICC的发生和发展过程中可能发挥着重要的作用，并且有望成为ICC 的潜在诊断指标之一。

1990 年，Geraghty 等［11］首次从B -LCL721.221细胞系中抽提出第3 个非经典HLA -Ⅰ类分子(又称为HLA-Ⅰb)，并命名为HLA -F，其基因位于人类6 号染色体短臂上，靠近着丝粒末端，全长5.4kb。HLA-F 分子是一个β2-微球蛋白相关的(40 ～41)kDa 大小的、具有相对较低多态性的蛋白。HLA -F基因亦由8 个外显子和7 个内含子组成，但成熟的mRNA 缺乏外显子7，导致其编码的HLA -F 蛋白尾部较其他HLA -Ⅰ类分子短［11，12］。HLA -F 即可存在于胞内，亦可表达于细胞膜表面。早期研究在细胞内检测到了HLA -F 蛋白表达，Wainwright 等［13］利用一种针对HLA -F a1 结构域的单克隆抗体，在外周血B 细胞，B 细胞株及含有B 细胞的组织(如成人扁桃体，婴儿肝脏)中发现了其胞内表达;Lepin 等［14］利用HLA-F 蛋白和β2-m 重组蛋白作为免疫原产生抗体，用该抗体检测发现扁桃体、脾脏及胸腺组织，和许多种组织及细胞株如膀胱、皮肤、肝脏细胞株等均有HLA-F 胞内表达。后期研究发现，在侵入母体蜕膜的绒毛膜滋养层细胞、EB 病毒转染的淋巴细胞株、以及活化后的B 细胞、T 细胞、NK 细胞、单核细胞等细胞表面均有HLA-F 表达［15～17］。

表1 ICC 癌灶区HLA-F 的表达量与临床病理因素的关系［n(%)］

目前认为HLA-F 主要功能是参与免疫调节，维持免疫耐受。Lepin 等［14］研究认为，HLA -F 可能是通过结合抑制性受体(ILT2 和ILT4)发挥免疫抑制作用。而Lee 等［17］研究发现HLA -F 表面表达与淋巴细胞活化同步，可以作为免疫系统激活的标志物，同时推测HLA-F 可作为信号分子，作用于调节性T 细胞，引起机体的免疫耐受。Goodridge 等［18］发现HLA-F 可以介导外源蛋白的MHC -Ⅰ类分子交叉递呈途径，并且不依赖TAP 及tapasin，对溶酶体酶抑制剂敏感，揭示了该途径对机体免疫调节和免疫防御的重要性，并且还分析了HLA -F 与MHC 分子的受体-配体关系，证实HLA-F 可以与NK 细胞和T 细胞上的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR3DL2、KIR2DS4)结合，作为配体，调节其免疫活性［18，19］。HLA -F 对维持正常妊娠具有特殊意义，从免疫学观点出发，胚胎是一个半异己的同种自然移植物，母体免疫系统中的免疫细胞能否识别并耐受胚胎抗原，直接影响妊娠的建立与维持，Shobu 等［20］发现HLA-F 参与了母胎耐受的建立，为胎儿生长准备适宜环境。当HLA -F表达改变时，会引起T 细胞、NK 细胞自体免疫反应，还导致各种免疫相关疾病，如呼吸道炎症、皮肤溃疡等［21］。而在肿瘤方面，我们早期已有实验研究了HLA- F 与非小细胞肺癌、食管鳞癌和胃癌的关系［7～9］:在肺癌组织中，24.1%(20/83)的癌灶组织表达HLA-F，但邻近正常组织不表达HLA -F，而食管鳞癌癌灶组织和邻近正常组织均有HLA-F 表达(阳性率分别为58.1%、54.8%)，HLA -F 在胃癌组织中的阳性率更是高达71.1%。进一步分析发现HLA-F表达量和肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM 分期等无明显相关性，但HLA-F 表达改变与肺癌、食管癌患者的预后相关。可见肿瘤细胞亦可能通过高表达HLAF，躲避机体免疫系统的监视，为其自身生长创造良好环境，HLA-F 维持免疫耐受的功能也更好解释并论证了我们的结论。同时，HLA-F 在上述3 种肿瘤组织中表现出不同的分布特点和临床相关性，推测HLAF 因肿瘤类型差异可表现出不同的生物学行为特点。

总之，HLA -F 在ICC 癌灶中表达升高，且与肿瘤数目及血管/淋巴管浸润等有关，提示HLA -F 在ICC 的发生和发展中可能发挥了重要的作用，并可能成为ICC 潜在诊断指标之一。HLA -F 的发现为肿瘤研究开启了新的领域，HLA-F 与ICC 的关系仍需进一步研究探索。

1 McGlynn KA，Tsao L，Hsing AW，et al. International trends and patterns of primary liver cancer［J］.Int J Cancer，2001，94(2):290-296

2 Goodman ZD. Neoplasms of the liver［J］. Mod Pathol，2007，20 Suppl 1N:S49 -60

3 Garrido F，Algarra I，Garcl'a-Lora AM. The escape of cancer from T lymphocytes immunoselection of MHC class I loss variants harboring structural-irreversible“hard”lesions［J］. Cancer Immunol Immun-other，2010，59:1601 -1606

4 Wischhusen J，Waschbisch A，Wiendl H. Immune-refractory cancers and their little helpers—an extended role for immunetolerogenic MHC molecules HLA - G and HLA - E?［J］. Semin Cancer Biol，2007，17:459 -468

5 Zhang J，Pan L，Chen L，et al. Non -classical MHC -Ⅰgenes in chronic hepatitis B and hepatocellular carcinoma［J］. Immunogenetics，2012，64(3):251 -258

6 Noguchi K，Isogai M，Kuwada E，et al. Detection of anti-HLA-F antibodies in sera from cancer patients［J］. Anticancer Res，2004，24(5C):3387 -3392

7 Lin A，Zhang X，Ruan YY，et al. HLA-F expression is a prognostic factor in patients with non-small-cell lung cancer［J］. Lung Cancer，2011，74(3):504 -509

8 Zhang X，Lin A，Zhang JG，et al. Alteration of HLA-F and HLA I antigen expression in the tumor is associated with survival in patients with esophageal squamous cell carcinoma［J］. Int J Cancer，2013，132:82 -89

9 Zhang JG，Zhang X，Lin A，et al. Lesion HLA-F expression is irrelevant to prognosis for patients with gastric cancer［J］. Hum Immunol，2013，74(7):828 -832

10 Edge SB，Byrd DR，Compton CC，et al. AJCC cancer staging manual［J］. New York:Springer-Verlag，2009:117 -126

11 Geraghty DE，Wei XH，Orr HT，et al. Human leukocyte antigen F(HLA- F). An expressed HLA gene composed of a class Ⅰcoding sequence linked to a novel transcribed repetitive element［J］. J Exp Med，1990，171:1 -18

12 Lury D，Epstein H，Holmes N. The human class I MHC gene HLAF is expressed in lymphocytes.Int［J］.Immunol，1990，2:532

13 Wainwright SD，Biro PA，Holmes CH. HLA -F is a predominantly empty，intracellular，TAP - associated MHC class Ib protein with a restricted expression pattern［J］. J Immunol，2000，164:319 -328

14 Lepin EJ，Bastin JM，Allan DS，et al. Functional characterization of HLA-F and binding of HLA-F tetramers to ILT2 and ILT4 receptors［J］. Eur J Immunol，2000，30:3552 -3561

15 Lee N，Geraghty DE. HLA-F surface expression on B cell and monocyte cell lines is partially independent from tapasin and complately independent from TAP［J］. J Immunol，2003，171:5264 -5271

16 Ishitani A，Sageshima N，Lee N，et al. Protein expression and peptide binding suggest unique and interacting functional roles for HLAE，F，and Ginmaternal-placental immune recognition［J］. J Immunol，2003，171:1376 -1384

17 Lee N，Ishitani A，Geraghty DE. HLA-F is a surface marker on activated lymphocytes［J］. Eur J Immunol 2010，40:2308 -2318

18 Goodridge JP，Lee N，Burian A，et al. HLA - F and MHC - I open conformers cooperate in a MHC -I antigen cross -presentation pathway［J］.J Immunol，2013，191:1567 -1577

19 Goodridge JP，Burian A，Lee N，et al. HLA-F and MHC class I open conformers are ligands for NK cell Ig-like receptors［J］.J Immunol，2013，191(7):3553 -3562

20 Shobu T，Sageshima N，Tokui H，et al.The surface expression of HIA-F on decidual trophoblasts increases from mid to term gestation［J］.J Repredlmmunol，2006，72(1 -2):18 -32

21 Furukawa H，Yabe T，Akaza T，et al. Cell surface expression of HLA-E molecules on PBMC from a TAP1 -deficient patient［J］. Tissue Antigens，1999，53:292 -295