黑龙江省稻瘟病菌无毒基因Avrpiz-t群体结构分析

张亚玲，何璘，靳学慧，王宝玉，付迪

（黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江 大庆 163319）

黑龙江省稻瘟病菌无毒基因Avrpiz-t群体结构分析

张亚玲，何璘，靳学慧，王宝玉，付迪

（黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江 大庆 163319）

利用NCBI中公布的Avrpiz-t基因序列设计特异引物，对黑龙江省四个作物种植区的108个稻瘟病菌菌株进行PCR扩增，明确稻瘟病菌无毒基因Avrpiz-t在黑龙江省四个作物种植区的分布情况。结果表明，供试108个菌株中有82%的菌株是正常基因，广泛分布于黑龙江省四个作物种植区，在供试的菌株中10.4%的菌株未扩增出条带，分布于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ作物种植区，第Ⅳ作物种植区的菌株均能扩增到条带；高带型菌株（有转座子Pot3插入）10个，占供试菌株的9.4%，在四个作物种植区内均有分布。

稻瘟病菌；无毒基因；群体结构；作物种植区

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzea B.Couch，无性态：Pyricularia grisea Cavara）引起的稻瘟病是水稻生产上最具毁灭性的病害之一[1-2]。目前，控制该病害最为经济有效且对环境安全的策略是抗病品种的使用。由于稻瘟病菌群体在田间极易发生变异，能快速地克服寄主的抗性而导致寄主“丧失”抗性变为感病。已知水稻与稻瘟病菌之间特异性互作，符合“基因对基因”学说[3]，即抗性基因与其相对应的无毒基因之间的特异性互作导致寄主表现抗性反应。因此，病原菌无毒基因的存在与分布情况研究对于指导抗病品种的合理使用、更好地防治稻瘟病具有重要意义。

水稻抗性基因piz-t是北方粳稻非常有利用价值的一个重要稻瘟菌抗性基因，稻瘟病菌无毒基因Avrpiz-t是在水稻稻瘟病菌第7号染色体上[4]，可编码108个氨基酸的分泌蛋白，不具有同源性。根据Li等研究表明，无毒基因Avrpiz-t在稻瘟病菌实验室测序菌株70-15上表现为在其CDS区-462 bp处有一转座子Pot3插入，使其失去功能[5]。黑龙江省属于高寒地区，根据各地积温的不同将黑龙江省划分为六个积温区，本研究结合黑龙江省水稻主要种植区域在四个积温区内采集稻瘟病菌菌株，对其无毒基因Avrpiz-t的分布特点进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

供试菌株为2012年秋季采集的黑龙江省水稻主栽地区稻瘟病菌菌株108个，分布于黑龙江省五个作物品种积温区划的四个积温带内。菌种保存于黑龙江八一农垦大学植物病理实验室。

表1 供试菌株及地点Table 1 Isolates and their region

1.2 方法

1.2.1 菌丝培养与收集

将供试菌株活化于米糠培养基上，培养10 d后，每个菌株挑取4块新鲜菌丝块（0.5 cm×0.5 cm）接种于经高压灭菌的酵母液体培养基（酵母4 g，葡萄糖10 g，琼脂粉5.5 g，500 mL水）中。然后置于摇床中28℃恒温，170 r·min-1振荡培养2～3 d，待菌丝体生长茂盛且未变黑时，灭菌纱布和滤纸真空过滤，再用灭菌蒸馏水抽洗2次，最后用滤纸尽可能地将菌丝中的水吸干，并分装于1.5 mL离心管中，置于-20℃冰箱中冷冻保存。

1.2.2 稻瘟病菌基因组DNA提取

取约150 mg冻干菌丝置于预冷研钵中，加液氮研磨至粉末，然后，用DNA抽提试剂盒（E.Z.N. A.RFungal DNA Kit，Omega公司，美国）对基因组DNA进行抽提，其提取方法参照试剂合说明书步骤进行。

1.2.3 特异性引物设计

根据GenBank中公布的Avrpiz-t基因核苷酸序列（EU837058），利用Primer premier 5.0软件引物，经BROAD搜索后确定特异性。其引物设计方法见图1，引物序列：

扩增片段长度如基因内有转座子Pot3插入为4 696 bp（高带型），如无转座子长度为2 834 bp（低带型），如未扩增出条带则为无带型。

1.2.4 PCR扩增

扩增采用20 μL体系包括：14.7 μL ddH2O，2 μL 10×buffer（含Mg2+），1.6 μL dNTPs（4×10 mmol·L-1），引物0.3 μL×2（2.5 μmol·L-1），1 μL Taq酶（2 U·μL-1），模板1 μL（45 ng·μL-1）。

图1 Avrpiz-t特点及引物设计Fig.1 Avrpiz-t characteristics and primer design

PCR反应参数：94℃预变性4 min；94℃45 s，56℃或60℃45 s，72℃90 s，36个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 明确目的基因

选取测序菌株guy11和供试菌株中随机取5个菌株进行扩增，将PCR产物纯化后送上海英俊生物技术有限公司测序。

1.2.6 基因型分析

观察并记载PCR产物在琼脂糖凝胶上的电泳结果，可将供试稻瘟病菌无毒基因Avrpiz-t划分为三种类型，即高带型、低带型和无带型。根据特异性条带的有无，统计出不同指纹类型的菌株。

2 结果与分析

2.1 供试菌株中Avrpiz-t存在与缺失分析

通过两对特异性引物检测108个稻瘟病菌菌株，发现供试菌株中有11个稻瘟病菌菌PCR扩增时无带（见图2），占供试菌株的10.4%（见表1）。在供试菌株中有近90%以上菌株都有该基因存在，说明Avrpiz-t基因在黑龙江省稻瘟病菌群体中分布较广。

2.2 无毒基因Avrpiz-t在黑龙江省四个积温带的分布

在第一积温带供试的21个菌株中有2个菌株未扩增到条带，占供试菌株的9.5%，包括黑龙江省西部的泰来县和肇源县。第二积温带供试的41个菌株中有6个未扩增出条带，占供试菌株的14.6%，其中绥化有2株，双河农场、红兴隆管局、密山市和八五七农场各1株。第三积温带供试的24个菌株中有3个未扩增出条带，占供试菌株的12.5%，分布于黑龙江省中部的庆安县和东部的八五二农场、八五六农场；第四积温带中供试菌株22个，没有未扩增出条带的菌株（见表2）。

图2 部分供试菌株Avrpiz-t扩增电泳Fig.2 Electrophoresis pattern of the isolates Avrpiz-t.

表2 供试菌株基因型表现Table 2 Gene type of isolates

2.3 无毒基因Avrpiz-t转座子存在情况分析

当Avrpiz-t启动子区域在基因上游462 bp处有转座子Pot3插入时会使基因功能破坏，因此本研究出现高带型基因即为有转座子Pot3插入（见图2）。研究结果表明供试的108个菌株中高带型菌株10个，占供试菌株的9.4%。四个积温带内都有高带型菌株存在，其中第Ⅳ积温带的供试菌株中所占比例最高，达18%（见表3）。

表3 供试菌株PCR扩增结果Table 3 PCR amplication results of the Avrpiz-t

续表

3 讨论与结论

根据已报道的稻瘟病菌无毒基因Avrpiz-t序列及基因特征，设计特异性引物对黑龙江省2012年采集的108个水稻稻瘟病菌菌株进行扩增，确定不同基因类型，明确稻瘟病菌无毒基因Avrpiz-t在黑龙江省各水稻种植区的分布，研究结果表明，稻瘟病菌无毒基因Avrpiz-t在黑龙江省稻瘟病菌中分布较广泛，供试的108个菌株在黑龙江省水稻种植的四个作物积温区内均有分布，且正常基因类型（低带型）占供试菌株的82%。说明稻瘟病菌无毒基因Avrpiz-t在黑龙江省各大水稻种植区域均分布广泛，在农业生产中种植带有稻瘟病抗病基因Piz-t的品种可减少稻瘟病发生。

供试的106个菌株中有11个菌株未扩增到条带，占供试菌株的10.4%，分布于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ积温带，而第四积温带菌株均能扩增到条带。此研究结果说明黑龙江稻瘟病菌存在Avrpiz-t缺失现象，这与孙庚等研究结果类似[7]。近年黑龙江省稻瘟病发生相对较重，稻瘟病菌中无毒基因的缺失或是水稻抗性基因的缺失都是稻瘟病发生的原因之一。

根据Avrpiz-t基因特点，在基因启动子区域可能会有一转座子Pot3插入，使基因表达不稳定，因此即使是该基因的保守序列在大多数供试菌株中都存在，但其表达情况也可能存在差异。本研究通过设计特异性引物明确稻瘟病菌中Pot3在启动子区域的存在情况，在供试的不同积温区内稻瘟病菌菌株中共有10个存在转座子Pot3插入情况，即高带型菌株，占供试菌株的9.4%，说明黑龙江省水稻种植区内有此类基因型存在，但不是主要类群，大部分菌株还是以正常基因型（低带型）的菌株类型存在。Li研究结果表明，当Avrpiz-t启动子区域内有转座子Pot3插入时其功能丧失[5]，转座子插入现象也可能是造成黑龙江省稻瘟病发生的原因之一。

关于黑龙江省水稻稻瘟病菌其他无毒基因群体构成的研究前面已有报道[6-10]，但对于Avrpiz-t研究还未见报道，本研究从基因型分析角度确定黑龙江省稻瘟病菌Avrpiz-t分布情况，在研究过程中未经过致病性鉴定，在后续研究中要结合致病性研究黑龙江省稻瘟病菌Avrpiz-t群体进化情况。

[1]Couch B C,Kohn L M.A multilocus gene genealogy concordant with host preference indicates segregation of a new species, Magnaporthe oryzea,from M.grisea[J].Mycologia,2002,94:683-693.

[2]Ou S H.Rice diseases commonwealth mycological institute[M]. 2nd ed.UK:Kew,Surrey,1985:109-201.

[3]Flor H.Current status of the gene-for-gene concept[J].American Annual Review of Phytopathology,1971,9(1):275-296.

[4]Xu J R,Xue C.Time for a blast:genomics of Magnaporthe grisea [J].Mol Plant Pathol,2002(3):173-176.

[5]Li W,Wang B,Wu J,et al.The Magnaporthe oryzae avirulence gene Avrpiz-t encodes a predicted secreted protein that triggers the immunity in rice mediated by the blast resistance gene Piz-t [J].MPMI,2009,22(4):411-420.

[6]张崎峰,靳学慧,蔡鑫鑫,等.利用SSR鉴定黑龙江省水稻稻瘟病菌无毒基因[J].中国农学通报,2010,26(10):250-254.

[7]孙庚,靳春鹏,陈婷婷,等.稻瘟病菌无毒基因检测及其指纹类型分析[J].生物技术通报,2011(6):122-126.

[8]张亚玲,周万福,靳学慧.黑龙江省稻瘟病菌与水稻品种的互作分析[J].东北农业大学学报,2011,42(1):28-33.

[9]刘华昭,刘延,刘化龙.黑龙江省种植品种中稻瘟病抗性基因Pib和Pita的分布[J].东北农业大学学报,2011,42(4):27-31.

[10]张俊华,刘洋,孙洪利,等.黑龙江省稻瘟病菌遗传多样性研究[J].东北农业大学学报,2013,44(1):34-38.

Population structure analysis of avirulence genesAvrpiz-tofMagnaporthe oryzeain Heilongjiang Province

ZHANG Yaling,HE Lin,JIN Xuehui, WANG Baoyu,FU Di
(Agricultural College Heilongjiang Bayi Agricultural University Daqing Heilongjiang 163319,China)

Using PCR amplification method,and avirulence genes Avrpiz-t that published in NCBI gene sequence to design specific primer,108 isolates of Magnaporthe oryzea of four cultivation in Heilongjiang Province were test,to make it clear the rice blast fungus avirulence gene Avrpiz-t in distribution of four crop-growing zone in Heilongjiang Province.Research results indicated that 82% strains had normal gene of the 108 strains for test,broad distribution in Heilongjiang Province four crop planting zones.There were 10.4%strains of the 108 strains for test no strape,and distribution inⅠ,ⅡandⅢcrop planting zones,and the isolates inⅣcrop planting district of strains were all had strape;10 strains with high strape type(Pot3 insert),which ccounted for 10%,and distributed in four a crop planting district.

Magnaporthe oryzea;avirulence gene;population structure;crop plant zone

S435.111.1

A

1005-9369（2014）01-0041-06

2013-07-18

黑龙江省自然基金项目（QC2011C046）；黑龙江省农垦总局科技攻关项目（HNK125A-08-06）；黑龙江八一农垦大学“大学生创新创业训练计划”项目（2012）

张亚玲（1977-），女，副教授，硕士，研究方向为植物真菌病害。E-mail:byndzyl@163.com

时间2014-1-9 21:09:57[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.2109.010.html

张亚玲,何璘,靳学慧,等.黑龙江省稻瘟病菌无毒基因Avrpiz-t群体结构分析[J].东北农业大学学报,2014,45(1):41-46.

Zhang Yaling,He Lin,Jin Xuehui,et al.Population structure analysis of avirulence genesAvrpiz-tofMagnaporthe oryzeain Heilongjiang Province[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(1):41-46.(in Chinese with English abstract)