亚麻SRAP标记连锁图谱的构建及3个数量性状的定位

李明，姜硕，郑东泽，杨勇

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

亚麻SRAP标记连锁图谱的构建及3个数量性状的定位

李明，姜硕，郑东泽，杨勇

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

以早熟、蒴果开裂、蓝花的典型种用农家种CN100910与中晚熟、白花、高纤的典型纤用亚麻Opaline杂交得到的F2群体作为构图群体，从513对SRAP引物中成功获得63对条带清晰、多态性好的引物，共产生249个多态性位点。其中169个位点构成含有18个连锁群，全长499.30 cM的亚麻连锁图，标记的平均图距为2.95 cM。其中较长的连锁群为L16，全长120.3 cM，有34个点被标记在连锁群上。最短的连锁群L9只有0.1 cM，仅两个位点被标记其上。在图谱上检测到与纤维含量、工艺长度和裂果性状有关的15个QTL。

亚麻；SRAP；连锁图谱

亚麻（Linum usitatissimum）是亚麻属一年生草本植物，在北温带地区分布很广，是在种植历史早期就已出现的古老韧皮纤维作物和油料作物[1]。近年来，分子标记技术在作物染色体连锁图谱构建上得到广泛应用，作物遗传图谱的发表数量每年都在稳步增加。亚麻作为重要的经济作物，关于其遗传图谱的报道极少，只有国外的几张图谱[1-4]，国内尚未见报道。

现有图谱及其QTL信息并不能满足育种工作需求，急需在原基础上加大图谱的密度和长度，并找到更多性状的QTL。SRAP（Sequence-related amplification polymorphism）是一种基于PCR的分子标记系统，具有操作简便迅速、成本低、可靠性好、重复性高的优点，可克服RAPD重复性差AFLP技术复杂、成本昂贵的缺点[5]。本研究选用油用农家种CN100910与纤用亚麻Opaline杂交得到的F2群体作为构图群体，利用SRAP分子标记技术，构建亚麻连锁图并定位部分性状QTL，分析性状遗传规律，可为基因克隆和分子辅助育种研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 作图群体构建

以Opaline作为母本，CN100910作为父本进行杂交得到F2代96个单株作为构建图谱的群体材料。Opaline是一种纤维含量较高的典型纤维亚麻品种，白花、种子千粒重较低、抗病性稍差，熟期中等。CN100910是一种具有蒴果开裂特点的典型种用农家种，蓝花、初花日数早、花期长、花枝较多，种子千粒重一般，熟期早熟。

1.2 农艺性状调查和统计

在后代群体收获后，调查其纤维含量、工艺长度及蒴果开裂情况，作为QTL分析的数据。

1.3 亚麻总DNA提取和检测

选取鲜嫩茎叶为材料，利用改良的CTAB法[6]提取亲本和作图群体的总DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，以DL2000 Marker为参照检测DNA浓度。

1.4 SRAP引物筛选

根据Li和Quiros等报道[7]，选用曾在黄麻中使用的SRAP引物[8]，上游引物19个（见表1），下游引物27个（见表2），由上海生工生物技术有限公司合成。

利用亲本的模板DNA对513对引物进行比对筛选，结果用6%变性聚丙烯凝胶电泳检测。初步筛选后，将多态性好的引物进行再次筛选。

表1 正向引物名称及引物序列Table 1 Name of the forward primer and primer sequences

SRAP-PCR扩增程序选用本研究室优化后的扩增程序：94℃预变性3 min；94℃变性10 s，35℃复性20 s，72℃延伸1 min，重复循环4次；94℃变性10 s，54.5℃复性20 s，72℃延伸1 min，重复循环38次；72℃延伸7 min后4℃终止并保存[9]。

1.5 数据分析和处理

首先分析引物的多态性及特异位点来源（来源于父本或母本）；其次对多态性标记进行命名。根据“上游引物+下游引物”+“条带顺序号”的方式为多态性标记命名，例如：上游引物Me1与下游引物Em1组合，电泳结果中总条带的第4条带为特异条带时，则此位点记录为“m1e1-4”。针对一个多态性位点，后代群体中该特异位点与父本CN100910相同的记作“a”，与母本Opaline相同的记作“b”，条带不清晰或结果缺失的记作“-”。

1.6 连锁图谱构建及QTL分析

选用Mapmaker/EXP 3.0软件进行连锁图谱的绘制。首先用sequence和group（LOD≥3）命令找出所有的可能子集，根据子集个数确定连锁群数目。用make chromosome命令设定连锁群LX（X= 1，2，3……），用sequence和anchor命令将子集中的标记瞄定到连锁群上，用sequence和assign命令对所有标记进行连锁分析，用attch命令将可能分配到两个不同连锁群上的标记分配到LOD值较大的连锁群上，最后用framework命令计算每个连锁群的遗传图距。通过WinQTLCart2.5软件运算遗传图距，用DrawChr按键绘制连锁图谱，并分析QTL信息，用画图软件将其标记到遗传图谱上。

表2 反向引物及引物序列Table 2 Name of reverse primer and primer sequences

2 结果与分析

2.1 SRAP分析

从513对引物中得到63对多态性好的引物组合，共扩增出条带842条，其中特异条带249条，占总条带数的29.57%。引物扩增的条带从3～28条不等，特异条带1～13条不等。在所有引物中，特异条带比率最低的是Me19Em19，仅为5.56%。特异条带比率最高的为Me7Em20，其特异性比率达76.47%，在所有特异性标记中，来自父本的标记数163个，占总特异性条带65.46%；来自母本的标记数86个，占总特异性条带的34.54%（见表3）。图1是引物对Me4Em10在亲本和F2群体中的扩增结果。

表3 最终筛选出的引物名称及其扩增条带Table 3 Primers screened and it's bands

引物名称Primer ID M5E14 M5E26 M10E17 M10E13 M6E1 M6E5 M10E18 M11E4 M6E8 M6E26 M6E27 M7E9 M7E10 M7E18 M7E20 M8E10 M10E21 M11E18 M7E26 M15E8 M12E14 M8E5条带来源Band origin父本Male总条带Total bands 10 16 13 10 16 16母本Female特异条带Special band多态性（%）Polymorphism总条带Total bands 15 28 15 16 17 7 10 13 12 17 21 12 11 10条带来源Band origin父本Male母本Female特异条带Special band多态性（%）Polymorphism 9 4 1 7 13 12 17 9 17 17 12 11 12 11 11 11 9 2 4 1 2 3 1 1 0 3 3 1 9 4 4 9 2 4 2 3 0 2 1 0 1 1 0 2 3 0 1 2 1 3 1 1 3 4 3 0 1 1 2 1 1 2 5 2 2 5 4 1 1 5 4 4 1 0 5 7 1 3 5 4 3 4 2 3 2 20.00 31.25 15.38 20.00 31.25 25.00 11.11 25.00 29.41 30.77 33.33 58.82 55.56 41.18 76.47 41.67 36.36 25.00 36.36 18.18 27.27 22.22引物名称Primer ID M15E24 M12E25 M14E6 M6E3 M15E25 M14E3 M16E12 M17E1 M15E4 M15E5 M16E24 M16E3 M16E15 M7E8 M19E8 M16E27 M14E7 M5E3 M18E3 M19E13 M19E19 8 8 1 3 8 1 8 14 18 1 2 0 1 1 1 3 4 3 3 5 3 3 2 2 3 3 1 1 2 1 1 3 2 2 1 1 1 1 2 2 1 1 1 0 0 0 3 0 2 1 0 2 5 2 3 2 2 4 5 5 5 6 4 4 2 2 3 6 1 3 3 1 13.33 17.86 13.33 18.75 11.76 28.57 40.00 38.46 41.67 29.41 28.57 33.33 36.36 20.00 25.00 37.50 46.15 12.50 16.67 21.43 5.56

图1 引物对Me4Em10在亲本和F2群体中的扩增结果Fig.1 Primer Me4Em10 amplification results in the parents an F2population

2.2 连锁图谱构建及QTL分析

利用Mapmaker/Exp 3.0b和WinQTLCart 2.5软件构建一张包含18个连锁群、共169个位点的亚麻连锁图谱。所有连锁群中，图距最长的连锁群是L16，包括34个多态性位点，总长120.30 cM，平均图距3.54 cM，图距最短的连锁群是L9，包括两个多态位点，两标记间图距0.1 cM。所有的连锁群上，标记间最短距离为0.10 cM，最长距离43.1 cM。连锁图总长499.30 cM，平均图距约为2.95 cM（见图2）。

图谱中偏分离位点80个，比率为47.3%。在这张连锁图谱上，除L1、L2、L5、L8、L10、L11、L12、L18外，其他8个连锁群都有偏分离标记存在（见表4）。

LOD≥2.5的条件下，与纤维含量有关的4个QTL分布在第2、17连锁群上，分布在第17连锁群上的3个位点都具有加性效应且都是主效基因，分布在第2连锁群上的位点具有负加性效应，是1个微效基因。贡献率分别21.93%、20.32%、23.35%和0.64%；与工艺长度有关的4个QTL中3个分布在第17连锁群上，贡献率分别31.48%、23.23%、23.56%，1个分布在18连锁群上，具有负加性效应，贡献率为0.84%，因此连锁群17与亚麻的纤维发育和纤维产量有密切关系，是重要1个连锁群。与裂果有关的7个QTL分布在第4、15、17连锁群上各有2、2、3个，贡献率分别为0.60%、0.12%、16.15%、0.28%、53.02%、6.67%和56.83%，也以第17连锁群上的贡献率较大。

图2 基于SRAP技术构建的亚麻连锁图谱Fig.2 Flax linkage map based on SRAP marker technique

表4 SRAP标记在连锁图谱上的分布Table 4 Distribution of SRAP markers on the linkage map

3 讨论与结论

相关序列扩增多态性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是基于PCR技术的新型分子标记技术，被广泛应用在植物遗传连锁图谱构建、重要标记定位、遗传多样性分析和杂种优势预测。本研究结果表明SRAP标记多态性较高、操作简便、条带易于分离，适合于构建亚麻连锁图谱。

Sprelmeyer等利用AFLP标记技术构建了第一张亚麻的遗传连锁图，图谱包括18个连锁群，覆盖基因组长度1 400 cM，因其群体构建基于亚麻枯萎病研究，有助于抗枯萎病基因的遗传定位[2]。Oh等应用RFLP与RAPD标记构建亚麻分子遗传图谱，图谱包括15个连锁群，共94个标记，覆盖基因组长度约1 000 cM[3]。Vromans利用AFLP技术绘制一张含有502个标记、共18个连锁群、覆盖基因组1 296 cM的遗传图谱，找到与12个性状有关的73个QTL[1]。Cloutier等利用新开发的EST-SSR构建一张含有24个连锁群、共113个标记的遗传连锁图谱，覆盖基因组长度833.8 cM，定位与亚麻脂肪酸成分有关的3个性状的QTL[4]。

本研究选用的两个亲本农艺性状差异极大，其中农家种CN100910接近野生，开花早，植株矮小，纤维含量低，蒴果开裂，种子产量较高，抗病性好。而Opalina是典型的高纤品种，抗病性稍差。二者后代多态性好，是理想的作图群体。在亚麻分子标记的应用上首次采用SRAP技术，得到一张含有18个连锁群，共169个位点，全长499.30 cM的亚麻连锁图，标记的平均图距为2.95 cM。其中较长的连锁群为L16，全长120.3 cM，有34个点被标记在连锁群上。最短的连锁群L9只有0.1 cM，仅两个位点被标记其上。与前人研究结果相比，图谱覆盖稍少，可能与试验所用F2群体数量较少及引物对数量少有关。亚麻遗传图谱的研究较少，现有的几个连锁图谱都只反映亚麻基因组的局部，需要进一步开展相关研究加以丰富。虽然本试验构造的图谱覆盖长度不长，但由于材料和分子标记的不同，可补充前人研究图谱中错过的连锁群或染色体区域。

偏分离不遵循分离规律，无法用传统的遗传理论和方法加以分析[10]。不同作物与不同分子标记所产生的偏分离现象也有所不同，李爱贤等利用SRAP标记技术绘制甘薯遗传图谱所统计1 199个标记中，有561个标记表现偏分离，频率46.8%[11]。王建设等利用同样的技术对中国香瓜和哈密瓜后代群体作图时仅在187个标记中发现8个偏分离标记[12]。本研究利用SRAP技术绘制亚麻连锁图谱得到的偏分离比率为47.3%，偏分离比率较高，可能与亲本间差异较大遗传距离较远有关。

LOD值是一个变量，表明主要和次要的QTL，主要的QTL可以解释高表型变异，次要QTL在选择性育种中发挥的作用也极其重要[13]。本试验选择LOD≥2.5既可以找到一些遗传效应较高的QTL，也可以找到一些遗传效应小的QTL。在LOD≥2.5时，即检测到与纤维含量、工艺长度和裂果性状有关的主效基因，也检测到与其相关的微效基因。其中与纤维含量有关的4个QTL中有3个为主效基因，最大贡献率为23.35%；检测到与工艺长度有关的4个QTL，最大贡献率达31.48%；裂果性状接近野生亚麻，本研究找到与裂果有关的7个QTL，最大的可以解释56.83%表型变异。3个性状的主要QTL都集中在连锁群17上，与相关性状进化有密切联系。

[1]Vromans J.Molecular genetic studies in flax(Linum usitatissimum L.)[D].Holland:Wageningen University,2006．

[2]Spielmeyer W,Green A G,Bittisnich D,et al．Identification of quantitative trait loci contributing to Fusarium wilt resistance on an AFLP linkage map of flax(Linum usitatissimum)[J].Theor Appl Genet,1998,97:633-641．

[3]Oh T J,Gorman M,Cullis C A.RFLP and RAPD mapping in flax (Linum usitatissimum)[J]．Theor Appl Genet,2000,101:590-593．

[4]Cloutier S,Ragupathy R,Niu Z X,et al.SSR-based linkage map of flax(Linum usitatissimum L.)and mapping of QTLs underlying fatty acid composition traits[J]．Mol Breeding,2011,28:437-451.

[5]张安世,邢智峰,刘永英,等.SRAP分子标记及其应用[J]．安徽农业科学,2007,3(9):2562-2563.

[6]苏钰．亚麻（Linum usitatissimum L.）EST-SSR标记开发及遗传图谱构建[D]．哈尔滨:东北农业大学,2011．

[7]Li G C,Quiros F．Sequence-related amplified polymorphism (SRAP),a new marker system based on a simple PCR reaction:Its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theor Appl Genet,2001,103:455-461．

[8]陈晖,陈美霞,陶爱芬,等.长果种黄麻SRAP标记遗传连锁图谱的构建及3个质量性状基因定位[J].中国农业科学,2011,44 (12):2422-2430．

[9]Li D M,Zhou Y D,Leng C,et al.Optimization of SRAP-PCR reaction system in flax[J].Journal of Northeast Agricultural University:English Edition,2009,16(2):17-22.

[10]Lu H,Romero-Severson J,Bernardo R．Chromosomal regions associated with segregation distortion in maize[J].Theoretical Applied Genetics,2002,105:622-628．

[11]李爱贤,刘庆昌,王庆美,等.利用SRAP标记构建甘薯分子连锁图谱[J].作物学报,2010,36(8):1286-1295．

[12]王建设,姚建春,刘玲,等.利用中国香瓜与哈密瓜的F2群体构建SRAP连锁遗传图谱[J].园艺学报,2007,34(1):135-140．

[13]李慧慧,张鲁燕,王建康.数量性状基因定位研究中若干常见问题的分析与解答[J].作物学报,2010,36(6):918-931.

LI Ming,JIANG Shuo,ZHENG Dongze, YANG Yong(School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

CN100910 that was typically landrace with traits of early mature,blue flower and dehiscent capsular and Opaline that was typically fiber variety with mid-late mature,white flower and high-fiber content were used as parents to construct a population of F2generation including 96 individual plants.A total of 513 sequence-related amplified polymorphisms(SRAP)primer pairs were used to screen the polymorphism of the parents,and obtained 63 primer pairs which produced 249 poly-morphological loci.A genetic linkage map consists of 18 linkage groups and covers 499.30 cM with an average genetic distance of 2.95 cM was constructed using 169 SRAP loci.Group 16 was the longest with distance of 120.3 cM,and contained 34 markers.Group 9 was the shortest with distance of 0.1 cM,and contained two markers.15 QTLs related to fiber content,the technical length and capsule dehiscent were detected on the map.

flax;SRAP;linkage map

S435

A

1005-9369（2014）02-0012-07

2012-10-19

哈尔滨市科技局科技创新项目（2009RFLXN015）

李明（1964-），男，研究员，博士，博士生导师，研究方向为作物生理与分子技术。E-mail:liming@neau.edu.cn

时间2014-1-17 16:42:16[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140117.1642.018.html

李明,姜硕,郑东泽,等.亚麻SRAP标记连锁图谱的构建及3个数量性状的定位[J].东北农业大学学报,2014,45(2):12-18.

Li Ming,Jiang Shuo,Zheng Dongze,et al.Construction of linkage map based on SRAP marker and mapping of three traits inLinum usitiatissimumL.[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(2):12-18.(in Chinese with English abstract)

Construction of linkage map based on SRAP marker and mapping of three traits inLinum usitiatissimumL.