耐贮型番茄子叶再生体系建立及优化

李文枫，李景富，许向阳，张贺

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

耐贮型番茄子叶再生体系建立及优化

李文枫，李景富*，许向阳，张贺

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

以耐贮型番茄08076和09836为试验材料，利用叶盘法以子叶为外植体，对不同浓度激素组合和基因型影响再生体系不定芽分化和再分化因素进行探讨，优化激素组合浓度并建立耐贮型番茄高效再生体系。结果表明，最佳分化培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1，最佳再分化培养基为MS+6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.75·L-1；不同基因型番茄的再生体系性状表现差异，其中平均出芽数差异显著。

耐贮型番茄；子叶；再生体系

番茄（Lycopersicuf esculentumMill）是世界上重要的蔬菜作物之一。含有rin或nor基因的番茄品系具有耐贮藏、适合运输和延长货架期特点，但这一特性常与果实品质下降相关联，其中最主要的番茄红素含量降低[1-2]。

本文提出以含rin、nor基因耐贮型番茄为受体材料，通过基因工程手段，将番茄高色素hp2基因转化到受体材料中，以有效提高番茄红素含量，选育既耐贮藏又具有优良商品性的番茄品种。但含rin、nor基因番茄材料为受体材料的再生体系尚未见报道，建立完善高效的耐贮型番茄再生体系尤为重要。

番茄属于双子叶植物，近年来，研究者多以MS培养基为基本培养基，以子叶或下胚轴为外植体[3-5]，采用生长素6-BA和细胞分裂素IAA或激动素ZT组合对番茄再生体系进行研究[6-8]。本研究以6-BA和IAA为主要研究因子，获得适合耐贮型番茄子叶再生体系的最佳浓度激素组合，为耐贮型番茄基因工程育种提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供试番茄材料08076和09836由东北农业大学番茄研究所提供。材料是该研究所通过传统育种方式，利用rin、nor基因分别改善优良品种获得的新耐贮型番茄材料。其中番茄品系08076含有迟熟rin基因，番茄品系09836含有成熟抑制nor基因。

1.1.2 试验试剂

MS（Murashige and Skoog）粉购自荷兰Duchefa公司；6-BA、IAA购自Sigma公司；蔗糖、琼脂为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 番茄种子表面消毒和无菌苗的培养

取籽粒饱满的番茄种子，用20%NaClO消毒15 min，无菌水洗3次，在灭菌的干燥滤纸上吸干残液，种子间隔5 mm均匀接种到无菌苗培养基（1/2MS基本培养基，pH 5.8，琼脂0.7%）上；在28℃黑暗条件下培养3～5 d，以胚根露出2～3 mm时移至人工培养箱光下继续培养，光照条件每天16 h，光照强度1 600～1 800 lx，培养温度为（26±1）℃，至无菌苗子叶展开真叶分化一心时，备用。

1.2.2 愈伤组织的诱导及不定芽分化

采用叶盘法以MS为基本培养基（pH 5.8，琼脂0.7%），附加不同浓度的细胞分裂素（6-BA）和生长素（IAA）。将6-BA浓度（1.0 mg·L-1，1.5 mg·L-1，2.0 mg·L-1）与IAA浓度（0.2 mg·L-1，0.5 mg·L-1，0.75 mg·L-1）设置9个组合（见表1）。每处理组合使用20个叶块，设置3次重复。

表1 不同浓度激素组合Table 1 Different concentrations of the hormone combination

具体操作为切除子叶叶尖和叶柄后，在最宽处纵切一刀，切成5 mm×5 mm的叶块，间隔1 cm均匀地接种到培养基上，每周继代一次；将其放到光照培养箱中培养，温度（26±1）℃，光照每天16 h，光照强度1 600～1 800 lx；接种21 d后统计愈伤数，接种40 d后统计出芽数和出芽总数，计算愈伤率、分化率和平均出芽数。

愈伤率（%）=有愈伤组织形成的外植体数/接种外植体数×100%；分化率（%）=有芽形成的外植体数/有愈伤的外植体数×100%；平均出芽数=总出芽数/有芽形成的外植体数。

1.2.3 数据统计分析

采用Excel 2007对数据进行整理和作图，DPS 7.5软件对数据进行方差分析和多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度激素组合对不定芽分化的影响

方差和多重比较分析表明，不同浓度的6-BA和IAA激素组合分别对番茄品系08076和09836不定芽愈伤率性状存在极显著差异（见表2，图1）。

番茄品系08076在6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1、6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1和6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1激素组合水平下愈伤率较低（≤90%），其中6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1激素组合水平下番茄品系08076愈伤率最低为88.33%。其他激素组合水平对番茄品系08076愈伤率均较高（95%～100%），在愈伤率性状上差异不显著；番茄品系09836在6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.5mg·L-1和6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1激素组合水平下愈伤率较低（≤90%），其中6-BA 1.5 mg·L-1+ IAA 0.2 mg·L-1激素组合水平下番茄品系09836愈伤率最低为88.33%。其他激素组合水平愈伤率均较高（95%～100%），除6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1外在愈伤率性状上差异不显著。同时表明，6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1激素组合水平下番茄品系08076和09836愈伤率均最高达100%。

表2 不同浓度激素组合对番茄品系08076和09836出愈率和分化率的影响Table 2 Effect of different concentration medium of 6-BA and IAA on frequency of callus and buds formation in tomato 08076 and 09836

图1 不同浓度激素组合对番茄品系08076和09836愈伤率的影响Fig.1 Effect of different hormone combinations on calli frequency from 08076 and 09836

2.2 不同浓度激素组合对不定芽再分化的影响

通过方差和多重比较分别分析不定芽再分化的两个指标，不定芽分化率和平均出芽数。

不同浓度的6-BA和IAA激素组合分别对番茄品系08076和09836不定芽分化率性状均存在显著差异（见表2，图2）。番茄品系08076在6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 0.75 mg·L-1、6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1和6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1激素组合水平上不定芽分化率较低（≤89.74%），其中6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1激素组合水平下番茄品系08076分化率最低为86.3%。其他激素组合水平分化率均较高（92.59%～98.25%），在不定芽分化率性状上差异不显著；番茄品系09836在6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1、6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1、6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.75 mg·L-1和6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1激素组合水平上不定芽分化率偏低（≤89.65%），其中6-BA 1.0 mg·L-1+ IAA 0.2 mg·L-1分化率最低为83.33%。其他激素组合水平分化率均较高（92.88%～100%），在不定芽分化率性状上差异不显著。同时表明，6-BA 1.5 mg·L-1+ IAA 0.75 mg·L-1激素组合水平下番茄品系08076和09836分化率最高，分别为98.25%和100%。

图2 不同浓度激素组合分别对番茄品系08076和09836分化率的影响Fig.2 Effect of different hormone combinations on differentiation frequency from 08076 and 09836

不同浓度的6-BA和IAA激素组合对番茄品系08076和09836平均出芽数性状均存在极显著差异（见表2，图3）。

品系08076平均出芽数大于5的激素组合处理1个，平均出芽数介于4～5的激素组合处理2个，平均出芽数介于3～4的激素组合处理3个，平均出芽数介于2～3的激素组合处理3个；品系09836平均出芽数大于6的激素组合处理1个，平均出芽数介于4～5的激素组合处理2个，平均出芽数介于3～4的激素组合处理5个，平均出芽数介于2～3的激素组合处理1个。同时表明，在对番茄品系08076和09836平均出芽数最高的3个激素组合水平中，IAA浓度均为0.75 mg·L-1，并以6-BA 1.5 mg·L-1+ IAA 0.75 mg·L-1平均出芽数最高。

图3 不同浓度激素组合对番茄品系08076和09836平均出芽数的影响Fig.3 Effect of different hormone combinations on average number of buds from 08076 and 09836

2.3 不同基因型对番茄再生体系性状的影响

在相同培养条件下，对08076和09836两个基因型再生体系性状愈伤率、分化率和平均出芽数的数据进行整体方差分析。由表3可知，6-BA和IAA浓度对08076和09836在愈伤率、分化率和平均出芽数性状上F值存在差异，前两者未达显著水平，但平均出芽数性状表现显著性差异。进而对平均出芽数采用新复极差法分析，表明09836平均出芽数（3.81±1.14aA）显著高于08076平均出芽数（3.58±1.12bA）。可判定基因型是决定不定芽再分化阶段的因素之一。

表3 不同处理间08076和09836再生体系性状的方差分析Table 3 Analysis variance of 08076 and 09836 regeneration with different treatments

3 讨论与结论

番茄不同基因型间不定芽的愈伤率和分化率有所不同[4,8-9]。本研究通过对比试验发现，在相同培养条件下番茄品系08076和09836不定芽分化和再分化各性状数值不同且获得高频再生体系，本试验中，两品系的不定芽分化率最低值为86%，从栽培角度分析分化率较高的原因可能与其分杈能力强有关系，可进一步从基因角度研究其不定芽分化率和平均出芽数较高的原因。

平均出芽数性状作为再生体系优化的重要指标之一，多数研究者在考查再生体系指标中明确了平均出芽数的重要性[9-10]，以平均出芽数多的材料为优，但是针对不同基因型在数据处理上未进行方差分析。利用品种间差异针对不同激素浓度组合，发现08076和09836处理间对平均出芽数产生显著差异，说明不同基因型番茄可能对再生体系中再分化阶段具有显著影响。针对不同基因型番茄品种的再生体系进行研究，再分化阶段应是研究重点，尤其平均出芽数指标不可或缺。利用方差分析同样验证09836的再生体系性状均高于或显著高于08076，番茄品系09836更适于作为遗传转化及相关研究的材料。

优化再生体系可构建更适合工业生产的激素浓度组合。通过优化激素浓度最终确定番茄品系08076和09836的高频再生体系以MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1为不定芽分化培养基，MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.75 mg·L-1为不定芽再分化培养基，为小浓度变化的激素水平组合筛选提供有力保障，达到预期试验结果起到优化作用。同时发现针对番茄品系08076和09836在分化和再分化过程中可考虑使用同一激素水平（6-BA 1.5 mg·L-1+ IAA 0.75 mg·L-1），均产生较高的愈伤率、分化率和平均出芽数，可再进一步细化激素浓度得到更适合工业化生产组培苗的再生体系培养基。

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Establish and optimize of plant regeneration system of long storage tomato cotyledon explants

LI Wenfeng,LI Jingfu,XU xiangyang,ZHANG He(School of Horticulture,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

In this research,we used long storage tomato genotype 08076 and 09836 as experiment materials,and leaf disc method to analyze different hormone concentrations,genotype affected to plant regeneration and redifferentiation,and optimize the combination of different hormone concentrations.The results showed that the best medium for regeneration was MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1,and the best medium for redifferentiation was MS+6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.75 mg·L-1;the average budding number performance significant different from genotype on regeneration system.

long storage tomato;cotyledons;regeneration system

X836

A

1005-9369（2014）02-0024-05

时间2014-1-17 16:41:47[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140117.1641.016.html

李文枫,李景富,许向阳,等.耐贮型番茄子叶再生体系建立及优化[J].东北农业大学学报,2014,45(2):24-28.

Li Wenfeng,Li Jingfu,Xu Xiangyang,et al.Establish and optimize of plant regeneration system of long storage tomato cotyledon explants[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(2):24-28.(in Chinese with English abstract)

2012-10-12

国家十二五科技支撑计划（2012BAD02B02）

李文枫（1982-），女，博士，研究方向为蔬菜种质资源创新及生物工程。E-mail：lwfangel@163.com

李景富，教授，博士生导师，研究方向为蔬菜作物遗传育种及生物技术。E-mail：Ljf-2005@126.com