番茄黄化突变体叶片蛋白双向电泳技术体系的优化

李景富，徐磊,2，张贺，许向阳，赵越，齐风坤

（1.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江省农业科学院大庆分院，黑龙江 大庆 161000）

番茄黄化突变体叶片蛋白双向电泳技术体系的优化

李景富1，徐磊1,2，张贺1，许向阳1，赵越1，齐风坤1

（1.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江省农业科学院大庆分院，黑龙江 大庆 161000）

蛋白质提取方法和电泳条件是研究双向电泳的关键。文章初步建立一套适合番茄黄化突变体叶片蛋白双向电泳(2-DE)分析的高效提取方法及电泳条件，比较3种蛋白提取方法，筛选最适胶条范围和上样量。结果表明，TCA丙酮法提取的番茄黄化突变体叶片蛋白质含量高、纯度佳、分离效果好；24 cm pH 4～7 IPG胶条适于番茄黄化突变体叶片蛋白分离；1 200 μg为最佳上样量。

番茄黄化突变体；双向电泳；技术体系；优化

李景富,徐磊,张贺,等.番茄黄化突变体叶片蛋白双向电泳技术体系的优化[J].东北农业大学学报,2014,45(4)∶46-50.

Li Jingfu,Xu Lei,Zhang He,et al.Optimization on two-dimensional electrophoresis technology system for leaves protein of tomato yellow leaf mutant[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶46-50.(in Chinese with English abstract)大多数突变体叶绿素含量低于对照植株50%。叶色突变体来源广泛，叶色突变可自然发生，也可人工诱变。其中插入突变和基因沉默突变等是叶色突变体的主要来源[1]。

目前，国内外已在大麦、玉米、春小麦、水稻、大豆、油菜、棉花等多种作物中发现或利用诱变技术创造此类突变体[2-3]。针对不同突变体，学者们在叶绿素含量和组成、光合能力、叶绿素荧光等方面进行大量研究，但不同突变体的研究结果不尽相同。

东北农业大学番茄课题组于1998年在田间露地种植的中蔬4号中发现自然突变的番茄叶色突变株，该突变株叶色黄化，成株苗叶片有黄斑，结果前期果实发白，转色慢，但果实能正常转为红色，果实硬度大。将该突变株单独留种，经多代自交形成遗传稳定的黄叶突变系。发现初期以果实颜色命名该突变体为番茄“白化”突变体，后更名为番茄叶色黄化突变体[4]，简称番茄黄化突变体，是优良的育种材料。

蛋白质组学是目前分离、鉴定蛋白表达差异最为有效的研究手段，该技术应用广泛[5]。近年来，关于植物突变体材料在蛋白质组学方面研究越来越多，在冬小麦[6]、水稻[7]、黄瓜[8]等突变体植株上均有相关报道。

双向电泳技术体系优化是蛋白质组学研究前提和基础，本文针对含番茄黄化突变体的黄化现象，比较3种蛋白提取方法，优化胶条范围和上样量选择，初步建立一套适合番茄黄化突变体叶片蛋白双向电泳分析的技术体系，为进一步开展番茄黄化突变体蛋白质组学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为番茄黄化突变体叶片，2011年4月在东北农业大学香坊农场实验实习基地种植番茄黄化突变体30株，于七叶一心时摘取黄化叶片，浸入液氮中，-80℃保存，提取蛋白，用于双向电泳分析。

1.2 蛋白质提取方法

1.2.1 TCA丙酮法

蛋白样品提取需在低温下操作，方法参照Gallardo等并略作调整[9]。取适量样品液氮研磨，研磨充分的样品转移至1.5 mL离心管中，并加入3倍体积-20℃预冷的丙酮（含10.0%TCA和0.7%β-巯基乙醇），-20℃沉淀过夜；然后4℃，15 000 r·min-1离心50 min，弃上清，留沉淀，再加入80%丙酮（内含0.07%β-巯基乙醇）去除色素及杂质，-20℃冷藏静置20 min；4℃，15 000 r·min-1离心30 min，弃上清，留沉淀，加入100%丙酮（内含0.07%β-巯基乙醇），冷藏20 min。4℃，15 000 r·min-1，离心30 min，弃上清，留沉淀，重复1～2次，直到有机相成无色为止。最后一次沉淀置于-20℃冻干，使丙酮完全挥发，-80℃保存干粉。

1.2.2 Tris-base丙酮法

参照Rabillowd[10]方法略作改进。

1.2.3 Tris-HCl法提取叶总蛋白

参照谷瑞升等[11]方法提取蛋白。

1.3 蛋白质含量测定

取蛋白质干粉10 mg，加入200 μL裂解液[7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4.0%（W/V）CHAPS,65 mmol·L-1DTT，2.0%（V/V）IPG Buffer（pH 3～10），Mil1iQ水溶解]。先在冰浴超声波中处理15 min，取出后在4℃摇床摇匀1 h，以上步骤重复2次，4℃，15 000 r·min-1离心50 min，取上清液，即为蛋白样品。采用Bradford法测定蛋白浓度[12]，在紫外分光光度波长为595 nm下测定光密度OD值，绘制标准曲线，依照标准曲线计算出样品蛋白浓度。

1.4 双向凝胶电泳

本试验选用24 cm pH 3～10、pH 4～7线性IPG胶条进行等电聚焦，优化胶条pH范围。按照GE双向电泳操作手册操作，蛋白上样量分别为1 000、1 200和1 400 μg，筛选最佳上样量。水化和聚焦在20℃自动进行，每胶条限流50 μA，总电压时间积为99 960 vh。聚焦完毕后，胶条先在平衡液I[0.375 mol·L-1，Tris-HCl(pH 8.8)，20.0%甘油，6 mol·L-1尿素，2.0%SDS，2.0%DTT]中于摇床平衡15 min，再在平衡液Ⅱ0.375 mol·L-1Tris-HCl（pH 8.8），20.0%甘油，6 mol·L-1尿素，2.0%SDS，2.0%IAA中平衡15 min,分离胶浓度选择12.5%。第二向电泳使用GE电泳系统，20 mA/胶条30 min，40 mA/胶条直至溴酚蓝前沿抵达凝胶底部为止。

1.5 考马斯亮蓝染色

电泳结束后将凝胶立即放入固定液中，固定1 h；再转入Mil1iQ水中水洗3～4次，每次15 min；换置胶条考染液（R350），90℃染色20 min；10%冰乙酸脱色，直到蛋白点清晰为止。脱色后的凝胶使用ImageScanner扫描成图谱。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法蛋白产量和蛋白点数比较

由表1可知，3种提取方法的总蛋白产量各不同，TCA丙酮法产量最高,达80.0 mg·g-1FW，比Tris-base丙酮法和Tris-HCl法分别高出51.5%和122.8%。从2-DE图谱上的蛋白点总数比较，TCA丙酮法最多达（612±20）个，其次为Tris-base丙酮法达（505±24）个，Tris-HCl最少，只有（230±12）个。因此，TCA丙酮法最适合番茄黄化突变体叶片蛋白的提取。

表1 不同提取方法蛋白产量和2-DE图谱中的蛋白点数Table 1 Protein yield and spots in 2-DE image of different extraction methods

2.2 不同蛋白提取方法单向SDS-PAGE凝胶图谱分辨率的比较

应用不同蛋白提取方法，提取相同重量番茄黄化突变体叶片的蛋白，然后以相同的蛋白上样量进行单向电泳，其单向聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图1所示，TCA丙酮法（第1泳道）在相对分子质量200.0～14.4 ku范围内提取的蛋白最全面；Tris-base丙酮法（第2泳道）在分子质量31.0～42.7 ku范围内蛋白条带较少，Tris-HCl（第3泳道）提取的蛋白在分子质量66.4和42.7 ku附近条带少。

图1 3种提取方法的番茄黄化突变体叶片蛋白SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE profiles of total proteins extracted from tomato yellow leaf mutant using three methods

2.3 IPG胶条pH范围的选择

用宽pH范围的3～10线性梯度胶条观察番茄黄化突变体蛋白整体分布结果如图2所示。从图2中可知，蛋白等电点多数集中分布pH 4～7范围内，根据这一结果，进一步把2-DE图谱分为：3≤pH＜4；4≤pH＜7；7≤pH＜10 3个区域，利用ImageMaster 2D platinum 7.0软件检测各区域中蛋白质点数量，统计其所占比例，有91.11%蛋白点稳定分布在4≤pH＜7区域内。由此，确定后续试验研究中适宜的IPG胶条pH范围为4～7，所以确定番茄黄化突变体双向电泳分析选用24 cm pH 4～7范围、线性梯度的胶条。

图2 pH范围3～10 IPG胶条2-DE图谱Fig.2 2-DE images from IPG strips of pH 3-10

2.4 蛋白上样量的选择

图3为1 000、1 200、1 400 μg蛋白质经考马斯亮蓝R350染色后的2-DE图谱。上样量为1 000的蛋白质图谱（见图3A），蛋白质点不清晰，而且低丰度蛋白检出量很少。上样量为1 400 μg的蛋白质图谱（见图3C），由于上样量过大，导致高丰度蛋白面积过大，高丰度蛋白质之间出现重叠现象，覆盖临近的低丰度蛋白，同时也出现明显的横纵条纹。上样量为1 200的蛋白质图谱（见图3B），蛋白点分离均匀，低丰度蛋白数量也明显增加，也加大Imagemaster 2D platinum 7.0图像分析软件对峰度识别的准确性，易于进行统计分析。据此认为，适合于番茄黄化突变体叶片蛋白质双向电泳的最佳的上样量为1 200 μg。

图3 不同上样量双向电泳图谱的比较Fig.3 Comparison of 2-DE patterns of internodes using different sample load

3 讨论

3.1 蛋白质提取方法

样品制备是研究双向电泳的关键。TCA丙酮法、Tris-base丙酮法、Tris-HCl法是蛋白质提取最常用的方法。由于不同物种不同器官或组织的化学组成不同，甚至同一植物不同组织其蛋白组成不同，所以其最适蛋白质提取方法也不同。本研究通过对上述3种蛋白质提取方法比较得出，TCA丙酮法提取番茄黄化突变体的蛋白质含量高、纯度佳、分离效果好，在SDS-PAGE凝胶电泳中显示的条带数量最多、最清晰，所以TCA丙酮法适合本试验。

3.2 胶条pH选择

2-DE差异蛋白质比较，选择合适pH的IPG胶条，得到清晰的蛋白质电泳图谱。本研究首先采用pH 3～10线性胶条对番茄黄化突变体蛋白质进行分离，发现大部分蛋白质集中在pH 4～7，蛋白点间紧密相连，甚至重叠，模糊且不易区分；使用pH 4～7范围的线性胶条进行双向电泳分离，可提高此区域分辨率，增加该pH范围内检测到的蛋白数。

3.3 上样量选择

上样量大小对双向电泳分辨率有直接作用。植物组织内大部分蛋白质的表达丰度较低，提高样品的上样量有助于低丰度蛋白检出。但等电聚焦过程中不能有太多离子，上样量越大，盐离子浓度越大，聚焦时电压上升很慢甚至不能达到设定电压，影响等点聚焦效果。另外，上样量过大，在重泡胀期和等电聚焦时易发生蛋白质凝聚和沉淀，产生水平和垂直纹理现象[13]。从样品制备方法、第一向IEF等电聚焦的电压设置、平衡时间、SDS-PAGE凝胶浓度和染色方法的灵敏度等综合考虑，比较上样量1 000、1 200、1 400 μg蛋白质，结果表明，当上样量为1 200 μg时，IPG胶条各点分离清晰，图谱质量好。

总之，采用TCA丙酮法制备番茄黄化突变体蛋白质干粉最佳，溶解后蛋白分离效果较好；选用24 cm，pH 4～7线性胶条得到的蛋白质电泳图谱最清晰，蛋白点数最多；第一向等电聚焦最适上样量为1 200 μg，图谱中蛋白点分离较好，图谱清晰。

[1]吕典华,王三根.水稻叶色突变体的光合和生理生化特性研究[D].重庆:西南大学,2010:1-3.

[2]Shen S,Jing Y,Kuang T.Proteomics approach to identify wound-response related proteins from rice leaf sheath[J].Pro⁃teomics,2003,3(4):527-535.

[3]Natarajan S,Xu C,Caperna T J,et al.Comparison of protein solu⁃bilization methods suitable for proteomic analysis of soybean seed proteins[J].Anal Biochem,2005,342:214-220.

[4]李景富,孟凡娟,许向阳,等.番茄白化突变体的发现及作为育种材料的鉴定[J].园艺学报,2006,33(2):384.

[5]郑天慧,宋波,姜自芹,等.大豆花瓣蛋白双向电泳分析技术体系的优化[J].哈尔滨师范大学学报,2010,26(6):75-80.

[6]赵明辉.冬小麦矮秆突变体DC20的蛋白质组学分析[D].乌鲁木齐:新疆农业大学,2009:15-20.

[7]陈熙,崔香菊,Zhao Y X,等.低叶绿素b水稻突变体类囊体膜的比较蛋白质组学[J].生物化学与生物物理进展,2006,33(7): 653-659.

[8]胡丹凤,高剑峰,李鸿彬.黄瓜芽黄突变体的蛋白组学研究[D].石河子:石河子大学,2010:28-33.

[9]Gallrdo K,Job C,Groot S P,et al.Proteomic analysis of Arabidop⁃sis seed germination and priming[J].Plant Physio1ogy,2001,126: 835-848.

[10]Rabilloud T.Use of thiourea to increase the solubility of mem⁃brane proteins in two-dimensional electrophoresis[J].Electropho⁃resis,1998,19:758-760.

[11]谷瑞升,刘群录,陈雪梅,等.植物蛋白质双向电泳分析方法的改进[J].北京林业大学学报,2006,21(5):7-10.

[12]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of pro⁃tein-dye binding[J].Anal Biochem,1976,72:248-254.

[13]王丽娟,任学敏,杜艳慧,等.菜籽蛋白质组双向电泳技术体系的优化研究[J].安徽农业科学,2011,39(17):10178-10181.

Optimization on two-dimensional electrophoresis technology system for leaves protein of tomato yellow leaf mutant

LI Jingfu1,XU Lei1,2,ZHANG He1,XU Xiangyang1,ZHAO Yue1,QI Fengkun1
(1.School of Horticulture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Branch of Daqing,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Daqing Heilongjiang 161000,China)

The method of protein extraction and the conditions of electrophphoresis are the key factors in two-dimensional electrophoresis(2-DE)research.The research preliminarily selected a technology system which was the best for the two-dimensional electrophoresis(2-DE)analysis on the leave protein of tomato yellow leaf mutant through comparing three different methods of protein extractions,various ranges of the immobilized gradient strips(IPG)and different protein quantities of sample-loading.The results showed that the proteins obtained from TCA/acetone precipitation method by which the efficient protein separation were high in content and purity.24 cm pH 4-7 immobilized gradient strips(IPG)was suitable for leave protein separation of tomato yellow leaf mutant and 1 200 μg was excellent in protein quantity of sample-loading.

tomato yellow leaf mutant;two-dimensional electrophoresis;technology system; optimization

S641.2

A

1005-9369（2014）04-0046-05

时间2014-4-21 13:23:52[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1324.020.html

2012-03-28

现代农业技术产业专项基金（CARS-25-A-15）

李景富（1943-），男，教授，博士生导师，研究方向为蔬菜作物遗传育种及生物技术。E-mail：Lijf_2005@126.com

叶片呈色取决于叶绿素和类胡萝卜素比例，比值3∶1，正常叶子呈绿色。但大多数植物叶片类胡萝卜素较叶绿素稳定，致使叶绿素数量少，叶色突变体多呈黄色。目前报道的植物叶色突变体中，