石油污染物对日本三角涡虫的毒理作用、摄食及再生的影响

韩亚鹏，范小峰，史红全，许姝娟，陈德来，张小霞

(1. 甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室;2. 庆阳市中心血站，甘肃 庆阳 745000)

随着经济的发展，人类对能源的需求不断扩大，石油的开发利用也迅速发展。而同时石油的开采、冶炼、使用和运输过程的污染和遗漏事故，以及含油废水的排放、污水灌溉、各种石油制品的挥发、完全燃烧物飘落等也都引起一系列石油污染问题。随着人们对环境问题的日益关注，石油污染研究也不断加强。

涡虫(D. japonica)隶属于扁形动物门、涡虫纲、涡虫属动物，是首先出现两侧对称、三胚层的动物，在动物系统演化中具有特殊地位。涡虫有很强的再生能力，是研究再生的理想材料，且具有分布广、个体小、结构简单、易培养、对水质变化敏感性强等特点，被常作为一类很好的水体污染指示生物。［1］近年来，用日本三角涡虫进行水生态毒理学的研究较多，主要涉及重金属离子对涡虫的急性毒性作用，［2］洗涤剂磷对日本三角涡虫生长的影响，［3］农药对日本三角涡虫摄食与再生的影响，［4－5］环境中无机盐对三角涡虫再生的影响［6］，而关于石油污染物对涡虫摄食与再生的影响未见相关报道。通过研究石油污染物对日本三角涡虫的急性毒性及摄食与再生的影响，探讨水环境中石油污染物对水生动物生长的影响，为利用日本三角涡虫检测环境污染提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物和试剂

试验所用日本三角涡虫采自甘肃省庆阳市合水县马莲河边山泉。日本三角涡虫在实验室喂养期间，每隔4d 用猪肝喂食一次，其间每喂食后4h 换隔夜自来水。试验前3d 停止喂食，试验温度为(21 ±1)℃。

石油购自庆阳市西峰油田第二炼油厂;试验用水为实验室隔夜自来水。

1.2 急性毒性试验

1.2.1 预试验

首先配置不同浓度试验液，对日本三角涡虫处理48h，经多次重复试验，得出处理24h、48h 石油污染物中日本三角涡虫100%致死的最低浓度b和0 致死的最高浓度a，分别记为b1、b2、a1、a2。

1.2.2 急性毒性试验

采用静水试验法，周期为24h 和48h。急性毒性试验按照国家环境保护局(2002)水和废水监测分析方法进行。根据预试验中所得的全致死和全不致死的浓度范围，按等对数间距分别设置毒性试验浓度梯度。24h 试验，浓度梯度分别为71.70、76.73、82.10、87.83、94.00、100.57g/L;48h试验，浓度梯度分别为50.00、52.43、55.13、57.87、60.76、63.33g/L。并分别设以对照。每组10 条日本三角涡虫，各设三个平行。

试验开始时，将配置好的不同浓度的石油污染物加入300mL 隔夜自来水，搅拌后静置，后将挑选的日本三角涡虫(最大伸展体长8 ～10mm)移入各个烧杯中，每个烧杯10 条。每隔6h 观察并记录日本三角涡虫的形态变化和存活数，以日本三角涡虫不蠕动记为死亡，［3］根据BL－420S 生物机能实验系统计算24h、48h 的LC50值。

1.3 日本三角涡虫摄食的实验

摄食试验浓度的设定主要参考石油污染物的安全浓 度 值［SC = LC50，24h× 0.3 ÷ (LC50，24h÷LC50，48h)3］，［7］石油污染物浓度分别设置为3.33、6.67、10.00、13.33、16.67g/L。每组10 条日本三角涡虫，每个浓度设三个重复，并各设以对照。

日本三角涡虫摄食实验开始时，先配置各个浓度的石油污染物溶液，待溶液澄清后，选择大小及生长状态相近的日本三角涡虫放入各个烧杯;待日本三角涡虫运动静止后(约30min)，在烧杯正中投喂一小块熟鸡蛋黄，并在喂食后的10、30、60min 观察涡虫摄食情况，为防水质变化和水分蒸发，每次喂食4h 后将涡虫移到新的测试液并于烧杯加盖后培养观察。以后每隔24h 喂食一次，并分别于喂食后的10、30、60min 观察日本三角涡虫摄食情况，记录日本三角涡虫摄食个数，试验持续3d。每次喂食后将日本三角涡虫肠管呈黄色定义为涡虫已摄食。［8］

1.4 日本三角涡虫再生的试验

参考石油污染物的安全浓度值［SC］，设置5个浓度组和1 个对照组，石油污染物的浓度分别为3.33、6.67、10.00、13.33、16.67g/L。每个浓度设3 个重复，每个重复10 条日本三角涡虫。

再生试验开始时，将日本三角涡虫逐条移至培养皿中用消毒刀片紧贴耳突后切去头部，收集“无头”日本三角涡虫放入盛有各浓度石油污染物的烧杯中进行再生观察。术后72h 开始，每隔6h于体视显微镜下进行1 次日本三角涡虫眼点再生观察并记录，以眼点重新出现作为再生完成的标志。［9］实验至128h (6d)，为提高观察效果，将完成眼点再生的涡虫移出，另行饲养。

1.5 数据处理

采用BL－420S 生物机能实验系统对石油污染物对日本三角涡虫的急性毒性数据进行分析;采用spss11.5 统计软件分别对日本三角涡虫摄食与再生的试验数据进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同石油污染物对日本三角涡虫的急性毒性

2.1.1 石油污染物对日本三角涡虫的半数致死浓度

急性毒性试验结果(表1)表明，石油污染物对日本三角涡虫的24h、48h LC50分别为83.47、56.83g/L，石油污染物对日本三角涡虫的安全浓度为7.90g/L。

表1 石油污染物对日本三角涡虫的急性毒性Tab 1 Acute toxicity of oil pollutant to D.japonica(n=10)

2.1.2 日本三角涡虫在不同石油污染物中的中毒状态观察发现日本三角涡虫在不同浓度的石油污染物中，其中毒形态存在一定差异。在石油污染物处理早期，主要表现为翻转、扭曲、螺旋、卷曲4 种状态。低浓度污染物作用下，48h 可明显观察到在日本三角涡虫躯体周围有透明凝胶状物质及内含的白色颗粒物，偶尔观察到日本三角涡虫体表有呈放射状分布的白色针状结晶物存在;在高浓度或长期作用时，日本三角涡虫死亡，其躯体膨胀呈白色，有时可看到咽露出或脱落。

2.2 石油污染物对日本三角涡虫摄食的影响

表2 显示，各浓度石油污染物对日本三角涡虫摄食均有一定影响。摄食时间相同，摄食个数随污染浓度增大而减少;相同浓度下，摄食个数随染毒时间延长而减少，24h 后差异显著 (p ＜0.05)。染毒24 ～48h 后，日本三角涡虫的摄食强度与污染浓度呈负相关，不同浓度石油污染物对日本三角涡虫的摄食影响差异显著，石油污染物对涡虫的摄食影响随石油污染物浓度的增大与染毒时间的延长而增大。

表2 石油污染物对日本三角涡虫摄食的影响Tab 2 Effect of oil pollutant on ingestion of D.japonica (n=10，mean±SE)

2.3 石油污染物对日本三角涡虫再生的影响

表3 石油污染物对日本三角涡虫再生的影响Tab 3 Effect of oil pollutant on D.japonica regeneration (n=10，mean±SE)

表3 显示，不同浓度石油污染物对日本三角涡虫再生的影响不同。低浓度(≤6.67g/L)的石油污染对日本三角涡虫再生的影响不显著(p ＞0.05);当污染浓度升高至10.00g/L 时，对日本三角涡虫再生的影响达显著水平(p ＜0.05)，且再生速度与浓度呈负相关。但随着处理时间的延长，石油污染物的影响逐渐减小;术后112h，石油污染物浓度≤10.00g/L 组中的日本三角涡虫完成再生，而至试验结 束，13.33 和16.67g/L 处 理 组 有16.67% 与56.70%的日本三角涡虫死亡，没有完成再生。

3 讨论

3.1 石油污染物对日本三角涡虫的急性毒性作用

实验结果发现石油污染物对日本三角涡虫24hLC50为83.47g/L，48hLC50为56.83g/L，其急性毒性属于低毒(LC50＞10mg/L)，它对日本三角涡虫生存的影响与废旧电池浸泡液［5］和农药［4］，［8］毒性一致，即随污染浓度增大和作用时间的延长，日本三角涡虫的死亡率增大。

日本三角涡虫在高浓度的石油污染物中有扭曲，翻转，卷曲，甚至咽部脱落，死亡等现象，这些现象与用N－N 二甲基甲酰胺［9］，重金属离子［2］处理涡虫后的形态表现相似。涡虫这些形态表现和死亡现象与石油污染物的理化性质相关，石油组成成分主要包括饱和烃、芳香烃类、沥青质和树脂等，作为污染物以石油薄膜、焦油团块、乳状和溶液状等三种形式存在于水中［10］。油膜覆盖在水溶液表面，严重影响了水与大气中氧气和二氧化碳的吸收［11］，水中氧化速度，氧气更换速度大大降低［12］，严重影响了水中的氧含量，促使涡虫缺氧死亡;焦油团块中重油、焦油和芳香族碳氢化合物成分越多，其毒性越大［11］，且浓度高时，直接粘附于涡虫体表，使其不能活动而死亡，另一方面石油烃会破坏虫体细胞膜的正常结构和透性，干扰涡虫体内的酶系［13］，进而影响了涡虫体内的生理生化过程，导致涡虫死亡;此外，在石油污染物的毒理作用下日本三角涡虫咽部与肠部结合部位的细胞表面粘着因子和胞外基质的某些糖蛋白的结构可能发生了较大变化，从而导致胞外基质三维结构的改变，细胞间粘连程度降低［6］，致使日本三角涡虫咽部脱落。

3.2 石油污染物对日本三角涡虫摄食的影响

石油污染物对日本三角涡虫的摄食影响随石油污染物浓度的增大与染毒时间的延长而增大。说明石油污染物对日本三角涡虫的摄食影响既有剂量效应也有时间效应。石油污染物对日本三角涡虫摄食的影响，可能是石油污染物直接粘附在涡虫体表，阻滞和破坏了与摄食相关的化学感受器的作用［8］，或者是石油污染物中毒性碳氢化合物作用于虫体使三角涡虫减少摄食或不再摄食。

染毒第1d 日本三角涡虫摄食略有异常，即距喂食60min 时，各浓度石油污染物未减少对日本三角涡虫的摄食虫数，这与石油污染物的时间效应有关，即石油污染物对日本三角涡虫处理时间越短，毒害效应越不明显。同时也说明60min 是石油污染物对日本三角涡虫的摄食影响的时间效应临界值。

3.3 石油污染物对日本三角涡虫再生的影响

在观察日本三角涡虫再生时，通过体视显微镜以观测到日本三角涡虫再生出眼点为再生完成标志，考虑到不同浓度组日本三角涡虫再生时间、速度都不相同，观察次数越多，观察时间越早，数据越精确，因此，试验中从术后72h 开始观察，并每隔8h 观察一次。

试验中(＞10g/L)的石油污染物即可延缓日本三角涡虫再生，且石油污染物浓度越高，对再生的抑制作用越明显。推测其原因是在较低浓度范围内日本三角涡虫可以通过自身调节减缓或削弱石油污染物的毒害作用，虽然时间延迟，但仍然可以完成再生;在相对较高浓度的持续作用下，日本三角涡虫机体调节系统被破坏，无法完成再生，最终死亡。

试验中随着处理时间的延长，石油污染物对日本三角涡虫再生的影响减小，这可能是因为再生早期日本三角涡虫对石油污染物的刺激产生了应激机制，再生差异显著，随着时间延长，日本三角涡虫对石油污染物的刺激出现适应，再生速度的差异减小或消失。

3.4 石油污染物对日本三角涡虫摄食与再生影响的浓度差异

实验结果发现，浓度≥3.33g/L 的石油污染物对日本三角涡虫的摄食有影响，但对再生有影响的浓度是≥10.00g/L，可见石油污染物对日本三角涡虫摄食的影响浓度小于对再生的影响浓度，且低于安全浓度值，说明涡虫对水质污染响应明显。按常规分析，切割对日本三角涡虫的伤害很大，石油污染物对其再生的影响浓度应该小于对摄食的影响浓度，而出现这种情况原因有两种，一是涡虫再生过程运动减少，未出现摄食行为，阻断了石油污染物从口咽进入体内的途径;此外可能原因是再生过程中日本三角涡虫成体多能干细胞(neoblasts)在切口处大量扩散增殖形成胚基［14，15］，由于胚基的形成而阻滞了石油污染物通过切口对日本三角涡虫的毒害作用。

从日本三角涡虫的急性毒性、摄食、再生三方面研究表明，石油污染物对日本三角涡虫有较明显的生物毒性，特别是日本三角涡虫对石油污染的摄食反应最为敏感，说明利用日本三角涡虫检测水环境中的石油污染有较好的应用前景。

［1］Liu D－Z.Chinese Freshwater Turbellarians Beijing［M］.Beijing Normal University Press，1993:181－182

［2］赵江沙，曾兆. 铜、汞、铅对涡虫的急性毒性作用［J］. 应用与环境生物学报，2004，10(6):750－753

［3］刘昌平，刘昌利，王希，等. 洗涤剂磷对日本三角涡虫生长的影响［J］. 环境科学导刊，2007，26(3):61－63

［4］刘昌利，席贻龙，黄林，等. 敌百虫和敌杀死对日本三角涡虫摄食与再生的影响［J］. 环境与健康杂志，2010，27(7):601－604

［5］刘昌利，席贻龙，黄林，等. 草甘膦、乙草胺对日本三角涡虫摄食与再生的影响［J］. 应用生态学报，2008，19(11):2509－2514

［6］薛得明，陈广文，李静静，等. 环境中无机盐对三角涡虫再生的影响［J］. 生物学杂志，2008，25(4):20－22

［7］Zhou Y－X(周永欣)，Zhang Z－S(章宗涉).Methods of Toxicity Test for Aquatic Animals Beijing［M］.China Agriculutural press，1989:1335－1339

［8］刘昌利，韦传宝，吴永明，等.5 种废旧电池浸泡液对日本三角涡虫生存与摄食的影响［J］. 癌变 畸变 突变，2007，19(32):238－238

［9］姚艳需，李治，孙艳，等.N－N 二甲基乙胺对东亚三角涡虫的毒性效应［J］. 西北大学学报，2011，41(5):833－837

［10］沈南南，李纯厚，王晓伟，等. 石油污染对海洋浮游生物的影响［J］. 生物技术通报(增刊)，2006:95－100

［11］曲维政，邓声贵，岳淑红. 海洋石油污染对海气正常交换过程的破坏性影响［J］. 自然灾害学报，2002，11(4):55－59

［12］曲维政，邓声贵. 灾害性的海洋石油污染［J］. 自然灾害学报，2001，10(1):69－74

［13］Мониин.А，Войтов.В，李若钝. 世界海洋石油污染物的地理分布及其消亡规律的研究［J］. 海岸工程，1995，14(1):27－30

［14］Newmark PA，Sanchez Alvarado A.Not your father＇s planarian:A classic model enters the era of functional genomics［J］.Nat Rev Genet，2002，3(2):210－219

［15］Reddien PW，Oviedo NJ，Jennings JR，et al.SMEDWI is a PIWI－like protein that regulates planarian stem cells［J］.Science，2005，310(5752):1327－1330