响应面法优化及制备丹参酮ⅡA 白蛋白纳米粒

刘丽薇， 承 伟

(辽宁医学院药学院，辽宁 锦州121000)

丹参酮是从唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge 根中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，其中丹参酮ⅡA是丹参中脂溶性成分的代表［1］。丹参酮ⅡA具有保护大脑、治疗心血管方面疾病、抑制肝细胞损伤、抗感染和抑制成纤维化神经元细胞增殖等多方面的药理作用。尤其近些年研究者越来越关注其在抗肿瘤方面的作用，并在临床上用于治疗肝肿瘤、胃肿瘤、白血病等疾病，显示出较好疗效［2-5］。研究表明通过联合使用丹参酮ⅡA，可使细胞停止生长，阻滞于G0/G1期，阻止细胞进入s 期、DNA 合成期，从而有效控制了癌细胞的生长繁殖［6］。丹参酮ⅡA作用于ERK 通路上抑制其活化程度，从而延缓卵巢癌细胞增殖，并使大量细胞被诱导凋亡，其主要作用机理是使降低bcl-2 表达，使Bax 表达上调［7］。由于丹参酮ⅡA为脂溶性小分子药物，口服生物利用度较低，在体内代谢和排泄较快［8］，故临床上多采用丹参酮ⅡA 磺酸钠注射液，但该制剂在临床应用时稳定性较差，刺激性较强，病人耐受性差［9］。本实验主要针对丹参酮ⅡA的化学性质，拟应用纳米生物给药系统，以提高丹参酮ⅡA的生物利用度以及延长其在体内的滞留时间，提高其抗肿瘤效果。作者采用牛血清白蛋白作为载体材料，白蛋白分子中的氨基酸通过肽键相互接接，形成大量的网状孔隙，并且互相扭曲形成团状，药物可镶嵌在其中，便于携带。同时具有可生物降解和低免疫原性的特点。采用去溶剂化交联法制备丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒，响应面法优化纳米粒处方工艺，并对其体外释放特性进行研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV-2450 紫外可见分光光度计(日本岛津公司);RC-6 溶出度测试仪(天津市新天光仪器分析技术有限公司);JEM-1200EX 透射电子显微镜(日本电子公司);KQ-300E 型超声波清洗器(上海生析超声仪器有限公司);透析袋(MV:1000-3000，美国spectrum 公司);Nano ZS90纳米粒度和Zeta 电位及分子量分析仪(英国Malvern 公司);

1.2 试药 牛血清白蛋白(BSA) (FractionV SIGMA 公司);丹参酮ⅡA对照品(中国食品药品检定研究院，编号110766-200918，纯度＞98%);丹参酮ⅡA(批号20090723，陕西昂盛生物医药科技有限公司，质量分数＞95%);其余试剂(分析纯，市售)。

2 方法与结果

2.1 丹参酮ⅡABSA 纳米粒的制备［10］通过去溶剂化交联法，取适量BSA 溶解于去离子水中，震荡、涡旋至全部溶解，取适量乙醇加入丹参酮ⅡA使之充分溶解。在一定转速搅拌下缓缓滴加含有药物的无水乙醇，注意控制滴速，至出现乳光后，滴加0.2%戊二醛，继续涡旋至混匀，旋转蒸发至除去乙醇，得到出现明显乳光的溶液体系，即得丹参酮ⅡABSA 纳米粒，继续搅拌一定时间，即得。最后经过冷冻干燥得到纳米粒。

2.2 检测波长的确立及绘制标准曲线

2.2.1 检测波长的选择 精密称取丹参酮ⅡA对照品适量，加乙醇定容至50 mL，配成对照品溶液。分别将对照品和辅料水溶液稀释至一定浓度后，以乙醇为空白对照，在波长260 ～600 nm 扫描，丹参酮ⅡA在270 nm 处有最大吸收，而除丹参酮ⅡA外的其他辅料在此波长下则不吸收。故选定270 nm 作为测定波长。

2.2.2 标准曲线的绘制 精密吸取对照品贮备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.5、5.0 mL 加乙醇定容至50 mL。以270 nm 吸光度(A)对丹参酮ⅡA的质量浓度(C)作标准曲线，进行标准曲线绘制，得到的标准回归方程A =0.012 6C+0.169 (n=6)，r =0.999 9，表明丹参酮ⅡA在3.06 ～30.6 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.3 测定纳米粒包封率 精密称取适量丹参酮ⅡABSA 纳米粒分散于10 mL 乙醇溶液中，在20 000 r/min 下冷冻离心30 min，根据回归方程计算上清液中的丹参酮ⅡA的量。即得到未被纳米粒包封的游离药物含有量，根据以下公式计算纳米粒包封率:

2.4 响应面分析方案及试验结果

2.4.1 模型建立与方差分析 在前期大量预试验的基础上，最终选定药物量与BSA 比例 (A)、乙醇与水比例(B)、乙醇滴速(C)3 因素作为考察对象，利用Design-Expert 软件，以药物包封率(EE%)为响应指标进行实验考察。根据Box-Benhnken 试验设计原理设计实验［11-12］，响应面分析方案见表1。回归方程各项的方差分析见表2。由Box-Benhnken 设计拟合，得响应值(Y)对编码自变量的二次多项回归方程为Y = +81.12 -3.96A -4.41B +2.43C -1.75AB+2.52AC+2.53BC- 8.14A2+1.01B2-4.21C2。对上述回归模型进行方差分析，回归模型的F 值为58.01，概率P ＜0.000 1，表明模型极显著。失拟项为0.65，没有显著性差异;其r2值为0.963 5，表明96.35% 响应值变化可以用此模型解释，这表明该模型相关性良好。从回归模型方差分析结果上看，该模型的拟合度较好。各因素的一次项存在极显著性，二次项A2、C2也表现出极显著性。

2.4.2 模型优化与预测 由回归方程经处理得到的药物量与BSA 比例、乙醇与水比例、乙醇滴速的交互作用对药物包封率影响的响应面。回归模型预测的最佳处方工艺为药物量与BSA 比例为0.09 (g/g)，乙醇与水比例为0.53(g/g)、乙醇滴速为1.27 mL/min，模型预测包封率为84.35%。

表1 响应面设计和包封率

表2 响应面法方差分析

2.4.3 验证试验 为验证响应面法的可靠性，采用上述最优条件进行丹参酮ⅡABSA 纳米粒制备，测定药物包封率重复3 次，结果见表3。获得的包封率分别为85.79%、87.43%、84.12%，平均包封率为85.78%，结果与预测值84.35%比较接近，所以，工艺条件采用响应面法进行筛选，数据准确可靠，具有一定的实际应用价值。模型预测值和实验观察值都比较接近，模型具有良好的预测性。

表3 响应面法验证试验结果

2.5 丹参酮ⅡABSA 纳米粒的形态学及粒径分析 通过透射电子显微镜观察纳米粒的形态和大小，在覆有支持膜的铜网上滴加丹参酮ⅡABSA 纳米粒溶液2 ～3 滴，干燥10 min，观察。见图1。从图1 可以看出，丹参酮ⅡABSA 纳米粒为球形或类球形，分散度和球形度良好，大小相对均一。

2.6 释放率测定 分别精密称取冷冻丹参酮ⅡABSA 纳米粒和丹参酮ⅡA原料药适量，置于透析袋中，扎紧袋口，悬浮于加有50 mL 磷酸盐缓冲液(pH 7.4)的具塞锥形瓶中，以100 r/min 的振荡频率于37 ℃下水浴振摇，在不同时间点(0.5、1、2、4、6、9、12、18、24 h)取透析液5 mL，照“2.3”项下进行含量分析，计算出各时间点的药物浓度和累积释放率，同时补加介质5 mL。取3 份样品平行实验，所得结果绘制累积释放率-时间曲线，比较丹参酮ⅡABSA 纳米粒与原料药体外释放行为。由图2 可以看出，纳米粒比原料药具有明显的缓释作用;原料药在4 h 内累计释放率为95.1%，基本释放完全。纳米粒的体外释放体现出两相释放形式，前4 h 药物累积释放率为(46.5 ±3.7)%，属于快速释放。4 h 后释药由药物扩散导致，24 h 累积释放率为(97.3 ±6.6)%，为缓慢低速释放。对最佳工艺条件制备的丹参酮ⅡABSA 纳米粒按不同释药模型拟合，由表4可看出，通过相关系数判断拟合程度，丹参酮ⅡABSA 纳米粒体外释放特征用一级方程拟合最佳。表明药物释放主要通过Fick 扩散完成。

图2 丹参酮ⅡA BSA 纳米粒和丹参酮ⅡA 原料药的体外释放曲线(n=3)

表4 丹参酮ⅡA BSA 纳米粒体外释药模型拟合

3 讨论

其他文献报道制备丹参酮ⅡA纳米粒所用的制备方法如乳化交联法、乳化溶剂挥发法，反应剧烈，并且需要采用大量有机溶剂［13-14］，药物包封率低［15］。本实验通过使用去溶剂化交联法制备丹参酮ⅡABSA 纳米粒，采用乙醇破坏BSA 周围形成的水化膜而使其沉淀出来，形成纳米粒。得到的纳米粒粒径均一，分散度好，药物的包封率高，纳米粒具有明显的缓释效应。本法制备工艺简单易行，反应温和，不需要使用有毒的有机溶剂，不存在溶剂残留问题。得到的分散体系通过加入戊二醛进行交联，提高纳米粒的分散度和稳定性。选用牛血清白蛋白(BSA)作为载体材料，生物相容性好，无免疫原性，BSA 已成为一种非常成熟的药物传递系统载体材料，常被作为药物及反义寡核苷酸的载体。

根据文献报道和已完成初步试验结果，笔者将其他条件固定，主要考察了药物量与BSA 比例、乙醇与水比例、乙醇滴速这3 个因素对纳米粒包封率的影响，以纳米粒的制剂学有关参数为指标，运用响应面法筛选出了丹参酮ⅡABSA 纳米粒合理的工艺条件，验证试验表明，处方工艺合理，稳定可行。

纳米粒体外释放呈现出一级释放特征，说明药物从纳米粒释放主要受Fick 扩散影响。初始阶段，吸附在纳米粒表面的药物与溶出液接触，进入溶出介质，造成药物快速释放。随着外液逐步扩散到其内部，再携带着丹参酮ⅡA从内部向外扩散;从整个释放过程可以看出，BSA 纳米粒能够使药物长时间维持在稳态浓度，能够起到控制药物缓慢释放作用，使其更好地发挥治疗效率。

［1］ 蔡丽萍，习志刚，杨 红. 丹参酮的药理作用和临床研究进展［J］. 广东药学院学报，2008，24(3):321-324.

［2］ 张民庆，龚惠明. 抗肿瘤中药的临床应用［M］. 北京:人民卫生出版社，1998:256-258.

［3］ 王 旭，颉玉欣，单保恩. TanⅡA 对人胃肿瘤BGC-823 细胞增殖及凋亡的影响［J］. 肿瘤防治，2008，20(1):56-59.

［4］ 冯玉光，邢国辉，宗绪山，等. TanⅡA 联合5-Fu 对人胃癌SGC7901 细胞增殖和凋亡与突变型p53 蛋白表达的研究［J］. 中华肿瘤防治杂志，2010，17(11):831-834.

［5］ 邢国辉，冯玉光，宗绪山，等. TanⅡA 联合5-Fu 对低氧下人胃癌SGC7901 细胞增殖、凋亡的影响及与HIF-1α 和突变型P53 表达的关系［J］. 世界华人消化杂志，2010，18(3):222-228.

［6］ 王修杰，袁淑兰，黄韧敏，等. Brdu 和PCNA 标记观察丹参酮对癌细胞增殖的影响［J］. 华西医科大学学报，1996，27(4):390.

［7］ 刘 伟，陈 吴. 丹参酮ⅡA对人卵巢癌细胞株CAOV-3增殖与凋亡的影响［J］. 医药导报，2007，26 (12):1398-1400.

［8］ 陈新谦，金有豫. 新编临床药物学［M］北京:人民卫生出版社，1998:101-105.

［9］ 钱名堃，杨保津，顾文华，等. 丹参有效成分的研究-I.TanⅡA 磺酸钠和次甲丹参醌的化学结构［J］. 化学学报，1978，36(3):199-206.

［10］ 张良珂，侯世祥，宋相容，等. 一种白蛋白纳米粒的制备与评价［J］. 中国药学杂志2007，42(5):365-367.

［11］ 李春英，李晓娟，杨 磊，等. 响应面分析法优化甘草酸和甘草黄酮联合提取工艺［J］. 黑龙江大学自然科学学报，2009，26(3):390-395.

［12］ 孙丽君，林长春，赵翔宇，等. 响应面设计优化超临界CO2抗溶剂法制备负载β-胡萝卜素的玉米蛋白纳米粒［J］. 食品科学，2011，32(8):19-23.

［13］ 甘良春，侯世祥，毕岳琦，等. 星点设计-效应面法优化丹参酮ⅡA纳米粒的制备工艺［J］. 中国药学杂志，2007，42(10):758-761.

［14］ 李 琦，王 炎，范忠泽，等. 丹参酮ⅡA及其纳米粒诱导肝癌细胞凋亡及对p38MAPK，TGFβ1 信号蛋白表达的影响［J］. 肿瘤，2008，28(1):8-12.

［15］ 安 芸，苗 方，尹祥敏，等. 丹参酮ⅡA固体脂质纳米粒的制备［J］. 医学理论与实践，2009，22(7):869-870.