分子印迹固相萃取-高效液相色谱法测定中成药中展青霉素

邓 鸣， 朱 斌* ， 宾春燕

(1. 广西食品药品检验所，广西 南宁530021;2. 广西医科大学，广西 南宁530021)

展青霉素是扩展青霉、展青霉、圆弧青霉等真菌的次级代谢产物，是一种遗传毒性化合物，存在致畸性、致癌性和免疫毒性［1］。由于展青霉素对人类可能造成的危害，世界上许多国家都规定了食品中展青霉素的限量值，我国国标GB 2761 -2011《食品中真菌毒素限量》中规定展青霉素的限量为50 μg/kg。展青霉素主要存在酸性果实中，在苹果、山楂及其制品中检出较多［2-3］。中药及中成药中亦有许多酸性果实类药材入药，但目前展青霉素检测研究报道多集中于果实类食品而关于中药相应检测方法报道较少。山楂麦曲颗粒和大山楂颗粒的主要原料均为山楂、麦芽及六神曲，这些中药材有可能受到真菌毒素污染，因此有必要检查其中展青霉素量，保证用药安全。

近几年来测定展青霉素的方法主要有高效液相色谱法［4-7］以及高效液相色谱-质谱联用法［8-10］，前处理方法有液液萃取 法［4，7］、固 相 萃 取 法［8，11］、多 功 能 净 化 柱 净 化法［5，10］等。液液萃取法的提取溶剂为乙酸乙酯，需消耗较多有机溶剂，操作步骤较为繁琐。固相萃取法常用C18或HLB 小柱进行提取液的净化，与液液萃取方法相比，样品用量和溶剂用量均明显减少，样品的纯化和富集过程可同时完成，缩短样品处理时间。多功能净化柱可选择性吸附样液中的杂质，而待测组分真菌毒素不被吸附而直接通过，该方法操作步骤简单，净化过程一步完成，已越来越多地应用于展青霉素测定中。分子印迹固相萃取柱，是运用分子印迹技术(molecular imprinting technique，MIT)原理，模拟抗原抗体反应模式，将样品中的目标分子进行特异性提纯处理和富集。目前针对真菌毒素的分子印迹固相萃取柱的使用已经有了一定的发展，并得到了广泛的关注［12］。实验中成功运用了展青霉素分子印迹柱对中成药提取液进行净化，其净化过程迅速，选择性高，可有效去除中药中众多干扰物质。该方法的建立为更好地评价和控制山楂麦曲颗粒和大山楂颗粒质量提供依据，也为其他中成药中的展青霉素测定提供参考方法。

1 仪器与材料

Agilent1200 型液相色谱仪(Agilent 公司);Milli-Q 去离子水发生器(Milli-Q 公司);OA-SYS 氮吹仪(Ttettich公司)。

展青霉素(patulin)对照品购于Supelco 公司，批号LB81487，纯度96.592%;羟甲基糠醛(HMF)对照品购于Dr. Ehrenstorfer Gmbh 公司，批号80606，纯度98.7%;甲醇、乙腈为色谱纯试剂，水为超纯水，其他试剂为分析纯;展青霉素分子印迹柱购于R. Biopharm 公司，Oasis HLB 固相萃取小柱(500 mg/6 mL)购于Waters 公司，Mycosep 228 AflaPat 多功能净化柱购于Romer 公司。

3 批山楂麦曲颗粒(15g/袋)、2 批大山楂颗粒(15 g/袋)样品购自本地药店。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil 100-5 C18色谱柱(5 μm，150 mm×4.6 mm);流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0 ～15 min，4% A;15 ～20 min，4% ～40% A;20 ～25 min，40% A;25 ～30 min，40% ～4% A)，体积流量1.0 mL/min;进样量50 μL;柱温35 ℃，检测波长276 nm。

2.2 样品制备 将供试品研细，称取约1 g 置于25 mL 具塞三角瓶中，加入5 mL 1%醋酸溶液，振摇溶解后超声提取5 min (超声频率40 kHz)。依次用2 mL 乙腈、2 mL 水淋洗活化小柱，取上述提取液于已活化的分子印迹柱上，自然重力滴下，分别用1 mL 1%碳酸氢钠溶液和2 mL 水淋洗，抽真空使柱子干燥，然后加入3 mL 乙酸乙酯溶液洗脱展青霉素，收集洗脱液于氮气流下40 ℃吹至近干，加入0.1%醋酸溶液溶解残渣并定容至1 mL，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，供高效液相色谱仪测定。

2.3 对照品溶液的制备 取展青霉素适量用甲醇配制成1 mg/mL 贮备液，置于4 ℃保存，临用时用0.1%乙酸溶液稀释成适当质量浓度的对照品溶液。取羟甲基糠醛适量用甲醇配制成1 mg/mL 贮备液，置于4 ℃保存。

2.4 线性关系及检测限 取展青霉素贮备液适量，配制成一系列质量浓度的对照品溶液，分别进样进行测定，以化合物峰面积(Y)和对应的质量浓度(X)进行线性回归，得到展青霉素线性范围4.83 ～96.59 ng/mL，线性方程Y=0.377X+0.030 6，相关系数r 为0.999 9，线性关系良好。

2.5 回收率试验 称取同一批阴性大山楂颗粒样品9 份，每份约1 g，分别按50、20、5 μg/kg 水平添加展青霉素对照品溶液，每个水平3 份供试品溶液，照“2.2”项方法处理后进样测定。结果展青霉素回收率在72.9% ～86.0%之间，RSD 在3.3% ～7.1%之间。

表1 展青霉素加标回收率

2.6 检测限 测定低添加水平回收率供试品溶液的信噪比，按信噪比为3 计算，方法检测限为3 μg/kg。

2.7 样品测定结果 应用建立的方法将收集到的3 批山楂麦曲颗粒、2 批大山楂颗粒进行测定，均未检出展青霉素。

3 讨论

3.1 色谱条件优化 流动相的组成及比例对待测组分的峰形、分离度均有影响。实验中对乙腈-水、四氢呋喃-水、乙腈-磷酸溶液(pH 2.5)等这3 种流动相体系进行了考察，结果四氢呋喃系统、乙腈-磷酸溶液(pH 2.5)系统的分离效果较差，而乙腈-水体系能很好地将展青霉素与杂质峰分离。通过调整流动相比例，当乙腈与水的比例为4 ∶96时，展青霉素出峰时间合适且分离度好。实验中还比较了Kromasil 100-5 C18、Hypesil ODS2 C18和Agilent XDB C18色谱柱的分离效果，在乙腈-水体系下以Kromasil 100-5 C18柱的分离效果最好，且峰形尖锐，灵敏度高。因此选择Kromasil 100-5 C18柱为分析柱，4%乙腈为流动相作为色谱分离系统(图1 ～3)。

图1 展青霉素对照溶液

图2 阴性样品溶液

图3 加标样品溶液

羟甲基糠醛是果实中己酮糖在酸性或高温环境下脱水形成的产物，与展青霉素化学结构相似，表现出相似的色谱行为，因此，羟甲基糠醛成为展青霉素测定时最常见、最易混淆的干扰物。在上述色谱系统下，将羟甲基糠醛和展青霉素的混合对照液进样，结果两者分离良好(图4)。

图4 羟甲基糠醛、展青霉素混合溶液

3.2 样品提取净化条件的考察 中药制剂中含有众多成分，而展青霉素又是痕量存在的，需要采用适当的提取和净化方式来对样品进行处理，以便尽可能地减少干扰，提高分析灵敏度。由于颗粒剂中含有大量的糖分，若提取溶剂量少则提取溶液黏稠，不易通过净化小柱，反之溶剂量过大则增加净化时间。通过比较，确定加入5 mL 提取液时，溶液黏度适中，过柱耗费时间合适。超声提取时间影响提取效率，实验中考察了提取时间分别为2、5、10 min的提取回收率，在5 min 时，提取回收率已经达到最大，增加超声时间，回收率并未显著增大。因此将提取溶剂体积定为5 mL，超声提取时间为5 min。

实验中比较了常用于展青霉素净化的几种小柱的净化效果:Oasis HLB 柱，mycosep 228 AflaPat 多功能净化小柱和展青霉素分子印迹柱。结果表明Oasis HLB 柱，mycosep 228 Aflapat 多功能净化小柱的净化效果不能满足要求，有杂质峰干扰展青霉素的测定，经过更换流动相组成及比例均难以将杂质与展青霉素分开，而采用展青霉素分子印迹柱净化后的供试液无杂质干扰，基线平稳，可准确地分析展青霉素，因此选择分子印迹柱作为净化方式。

实验中考察了在分子印迹柱上不同的洗脱溶剂 (乙醚、乙腈、甲醇、乙酸乙酯)对加标样品的洗脱效果，结果表明乙酸乙酯的平均回收率最高，为77.1%，甲醇和乙醚的平均回收率分别为52.3%、40.5%，乙腈洗脱溶液中有干扰峰，未能计算回收率。比较之下乙酸乙酯洗脱色谱图杂质干扰峰少，回收率较高，洗脱效果好，因此，选择乙酸乙酯作为洗脱液。

本实验建立了山楂麦曲颗粒和大山楂颗粒中展青霉素的高效液相色谱检测方法，采用展青霉素分子印迹固相亲和柱对提取液进行净化可很好地去除干扰物，提高分析方法的专属性。该方法操作简便、快速、灵敏度高，回收率好，适用于中药制剂的展青霉素的测定。

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