超高效液相色谱串联质谱法检测葛花中异黄酮

王金凤， 魏 颖， 王 芳， 杨翠燕， 王国玉， 张 琦， 刘 丹

(中国人民解放军第二○八医院，吉林 长春130062)

葛花是豆科植物葛根Pueraria lobata (willd.)Ohwi 的干燥花蕾。《神农本草经》记载葛花主要用于解酒醒脾，治伤酒发热烦渴、不思饮食、呕呃吐酸、吐血和肠风下血等症［1］，是最具代表性的解酒药物。现代药学研究发现葛花的主要有效成分为异黄酮类化合物［2-9］，有抗氧化损伤、降糖、降脂、抗炎、抗过敏、抗肿瘤和防治糖尿病并发症等多种生物活性，具有重要的保健和药用价值。本研究采用超高效液相色谱-质谱联用的方法检测葛花中的异黄酮成分，为其开发应用奠定基础。

1 村料与方法

1.1 仪器与试剂 LTQ 超高效液相色谱-质谱系统(美国，Thermo 公司)，Waters H-class 超高效液相色谱系统，配备电喷雾离子源。CP225D 电子天平(德国赛多利斯股份公司);葛花(河南广安堂贸易有限公司20110817);鸢尾苷和鸢尾苷元对照品为实验室自制 (20050817，20051208);大豆苷、大豆苷元和染料木黄酮对照品购自上海同田生物技术股份有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯 (美国Fisher 公司);实验用水为双蒸水，其他试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱 (150 mm× 4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-乙腈-水(2 ∶1 ∶2)，体积流量0.5 mL/min;检测波长264 nm;柱温25 ℃;进样量10 μL。

1.2.2 质谱条件 喷雾电压4.5 kV，金属毛细管温度250 ℃，鞘气为N2，体积流量0.45 L/min，辅助气体为He，体积流量3 L/min，分析条件采用负离子模式，扫描范围为m/z 200 ～1 500 Da。

2 样品溶液的制备

2.1 葛花异黄酮的制备 葛花药材500 g 制成粗粉，85%乙醇索氏回流提取20 h，旋转蒸发仪减压浓缩至膏状，参照文献［10-11］方法采用乙酸乙酯萃取纯化，60 ℃真空干燥制得葛花异黄酮。

2.2 葛花异黄酮的酸解 葛花异黄酮500 mg 加入75%乙醇100 mL 溶解后加入浓盐酸30 mL，摇匀，80 ℃水浴12 h。冷却后加入氢氧化钠调pH 为7.0，减压回收乙醇，沉淀物加去离子水洗涤3 次，60 ℃真空干燥备用。

2.3 检测样品制备 精密称取葛花异黄酮酸解前后样品各2 mg，分别放置于25 mL 量瓶中，加入流动相，超声处理10 min，冷却至室温，用流动相定容。用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取滤液用于检测。

3 结果与讨论

葛花乙醇提取物，经乙酸乙酯萃取得到了纯化较好的异黄酮成分。参考文献［12］以甲醇-乙腈-水(2 ∶1 ∶2)为流动相，样品中异黄酮成分分离度较好，基线平稳，分离效果理想，有7 个主要的色谱峰得到较好的分离，如图1 示。酸解后峰1、2 消失，峰3 明显缩小，峰4、5、7 升高，推测前者为后者的糖苷。由于葛花的主要化学成分为异黄酮类化合物，用负离子电喷雾质谱检测所得的总离子流图有较好的信噪比，对应化合物的质谱图都呈现出很强的［M-H］-准离子峰，见图2。通过与对照品保留时间、质谱信息进行对比，峰1、3、4、6 和7 得到了确证。其准分子离子峰［M-H］分别为:m/z 415、461、253、269、299，表明其相对分子质量分别为416、462、254、270 和300，通过与对照品对比并参考文献报道［13-14］，确定为大豆苷 (daidzin)、鸢尾苷 (tectoridin)、大豆苷元(daidzein)、染料木黄酮(genistin)和鸢尾苷元(tectorigenin);峰2 和5 的［M-H］-准离子峰分别是445 和283，表明其相对分子质量为446 和284，峰2 酸解后可转化为峰5，表明其为峰5 的糖苷，根据文献［15］ 报道推测其为印度黄檀苷(sissotrin)和鸡豆黄素(biochanin A)。见表1。

图1 总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms

表1 葛花异黄酮HPLC-MS/MS 结果Tab.1 HPLC-MS/MS results of Pueraria lobata isoflavone

4 结论

图2 葛花异黄酮的质谱图Fig.2 Chromatograms of Pueraria lobata isoflavone

葛花异黄酮具有多种生物活性，市场前景广阔。本实验通过UPLC-MS/MS 对葛花提取物进行分析，研究了其乙醇提取、乙酸乙酯纯化后的化学成分，通过HPLC 分离得到了7 个化合物，均为异黄酮成分。经酸解得到4 个异黄酮苷元。本研究显示UPLC-MS/MS 能快速分析鉴定葛花提取物的异黄酮成分，具有快速、准确和灵敏度高的特点，可以作为葛花异黄酮鉴定的有效方法。

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