黑斑蛤蚧对哮喘模型小鼠的免疫调节的影响

廖成成， 臧 宁， 班建东， 唐景财， 何 敏， 李 力

(1. 广西医科大学附属肿瘤医院，广西 南宁530000;2. 广西医科大学医学科学实验中心，广西 南宁530021;3. 广西壮族自治区药用植物园，广西 南宁530023)

哮喘严重危害人类健康，发病人数逐年增加，预防和控制任务艰巨。 《本草纲目》记载蛤蚧(gecko)可用于虚喘气促，临床和民间应用均显示其可用于治疗支气管哮喘［1］。目前普遍认为免疫失调是引发该病的重要原因。本研究通过观察黑斑蛤蚧对过敏性哮喘小鼠血清中白介素4(IL-4)、白介素5 (IL-5)以及干扰素γ (IFN-γ)的影响，探讨蛤蚧对BALB/c 哮喘模型小鼠的治疗作用，进一步为黑斑蛤蚧的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 4 周龄SPF 级雌性BALB/c 小鼠购自广东省医学实验动物中心(实验动物合格证号:0046242)，10 只1 笼，继续喂养至体质量25 ～30 g。

1.2 试剂与药物 卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)购自Sigma 公司;氢氧化铝(上海生化试剂厂);地塞米松(天津天药药业股份有限公司);生理盐水(广西医科大学制药厂);ELISA 试剂盒(上海西塘生物科技有限公司);黑斑蛤蚧粉由广西药用植物园提供，产地为广西大新县宝圩乡。蛤蚧除去内脏，60 ℃置烘箱内烘干，粉碎成粉末。

1.3 仪器 酶标仪为BioRad 公司的iMark680，超声雾化器(402B)为江苏鱼跃医疗设备股份有限公司产品;自制小鼠雾化吸入箱材料为塑料，尺寸为(55 cm×35 cm ×30 cm)。

1.4 方法

1.4.1 哮喘模型的制备 50 只BALB/c 小鼠，10只为正常对照，不参与建模，其余40 只参照参考文献［2-6］方法，小鼠分别于第1、第7 和第14天腹腔注射200 μL 内含10 μg OVA、40 mg 氢氧化铝的生理盐水致敏。第15 天开始将上述小鼠一起置于雾化箱中，以1%OVA 生理盐水雾化激发。雾化器动力为1.7 MHz，雾化率为2 mL/min，每天1次，每次30 min，共激发14 d。观察小鼠是否出现烦躁、呼吸急促、哮鸣音、腹肌抽搐及口唇紫绀等症状，参与建模的小鼠均出现不同程度的上述症状，说明建模成功。

1.4.2 动物分组与给药 50 只BALB/c 小鼠随机分为10 只正常对照组及40 只哮喘模型组。建模成功的哮喘模型组被随机分为3 组:黑点蛤蚧干预组、地塞米松干预组、生理盐水组，每组10 只。最后一次致敏后第2 天开始给药，黑斑蛤蚧组小鼠给药剂量为1 g/kg，6 g 黑斑蛤蚧干粉加100 mL 生理盐水调和，每只小鼠(按30 g 体质量)0.5 mL灌胃给药。地塞米松组给药剂量为0.20 mg/mL，每只小鼠(按30 g 体质量)0.5 mL 灌胃给药。生理盐水组及正常对照组均以生理盐水0.5 mL 灌胃给药。各组连续给药7 d。

1.4.3 血清样本制备 给药结束后第2 天，3 组小鼠摘除眼球取血，室温静置1 h;于40 ℃，1 500 r/min 离心10 min，吸取血清，分装后冻存于-20 ℃。

1.4.4 血清中IL-5、IL-4、IFN-γ 的测定 采用ELISA 双抗体夹心法测定，按试剂盒操作说明书进行检测。

2 结果

2.1 正常对照组与生理盐水组的Th1，Th2 失衡分析 IFN-γ 代表Th1 型细胞因子，IL-4、IL-5 代表Th2 型细胞因子，可通过小鼠血清细胞因子的变化分析建模后Th1、Th2 失衡的情况。如表1 所示，生理盐水组较正常对照组IL-4 和IL-5 水平均有显著升高(P ＜0.05)，IFN-γ 则有显著降低(P ＜0.05)。

表1 正常对照组与生理盐水组小鼠血清中IL-4、IL-5 和IFN-γ 变化(±s)Tab.1 Changes of IL-4，IL-5 and IFN-γ between the control group and saline group in mice serum (±s)

表1 正常对照组与生理盐水组小鼠血清中IL-4、IL-5 和IFN-γ 变化(±s)Tab.1 Changes of IL-4，IL-5 and IFN-γ between the control group and saline group in mice serum (±s)

注:与正常对照组比较，* P ＜0.05

组别 动物数IL-5/(pg·mL -1)IL-4/(pg·mL -1)IFN-γ/(pg·mL -1)10 13.00 ±2.09 14.60 ±3.50 389.76 ±22.34生理盐水组 10 48.09 ±7.23* 47.18 ±4.46* 135.18 ±20.01正常对照组*

2.2 干预后各组小鼠血清中IL-5、IL-4、IFN-γ 的变化 黑斑蛤蚧干预组、地塞米松干预组与生理盐水组相比较，IL-4 和IL-5 水平均有显著降低(P ＜0.05)，IFN-γ 则有显著提高(P ＜0.05);黑斑蛤蚧干预组与地塞米松干预组比较，地塞米松下调IL-4 和IL-5 水平和上调IFN-γ 水平的作用均强于黑斑蛤蚧(P ＜0.05)，见表2。

表2 干预后各组小鼠血清中IL-4、IL-5 和IFN-γ 变化(±s)Tab.2 Changes of IL-4，IL-5 and IFN-γ after the intervention (±s)

表2 干预后各组小鼠血清中IL-4、IL-5 和IFN-γ 变化(±s)Tab.2 Changes of IL-4，IL-5 and IFN-γ after the intervention (±s)

注:与生理盐水组比较，* P ＜0.05;与地塞米松干预组比较，ΔP ＜0.05

组 别 动物数 IL-5/(pg·mL -1) IL-4/(pg·mL -1) IFN-γ/(pg·mL -1)黑斑蛤蚧干预组 10 22.93 ±1.33* Δ 15.12 ±2.87* Δ 325.66 ±27.17*Δ地塞米松干预组 10 17.00 ±3.36* 11.60 ±2.82* 353.11 ±25.24*生理盐水组10 48.09 ±7.23 47.18 ±4.46 135.18 ±20.01

2.3 各组小鼠干预后Th1、Th2 相关的细胞因子相关性分析 IL-4 和IL-5 属于Th2 系统的细胞因子，而IFN-γ 属于Th1 系统的细胞因子。为比较蛤蚧在干预过程中是否因IL-4 和IL-5 与IFN-γ 水平失衡的关系导致哮喘症状减轻，对Th1、Th2 相关的细胞因子相关性进行分析。

黑斑蛤蚧干预组的IFN-γ 水平分别与IL-4、IL-5 水平呈负相关(r = -0.61， -0.71)，IL-4、IL-5 水平呈正相关(r=0.62)，P 值均＜0.05。地塞米松干预组的IFN-γ 水平分别与IL-4、IL-5 水平呈负相关(r = -0.76， -0.75)，IL-4、IL-5 水平呈正相关(r=0.76)，P 值均＜0.05。生理盐水组IFN-γ 水平分别与IL-4、IL-5 水平呈负相关(r =-0.53，-0.62)，IL-4、IL-5 水平呈正相关(r =0.65)，P 值均＜0.05。见表3。

表3 小鼠血清细胞因子相关性分析Tab.3 Correlational analysis of cytokines in mice serum

2.4 黑斑蛤蚧与地塞米松的疗效比较 IL-4 和IL-5 属于Th2 系统的细胞因子，而IFN-γ 属于Th1 系统的细胞因子。为比较蛤蚧在干预过程中对Th1/Th2 的影响，Th1/Th2 的平衡情况通过IFN-γ/ IL-4和IFN-γ/ IL-5 反映。如表4 所示，3 组比较，地塞米松干预组与黑斑蛤蚧干预组的IFN-γ/ IL-4 和IFN-γ/ IL-5 均比生理盐水组有显著升高 (P ＜0.05)，两组间比较，地塞米松干预组较黑斑蛤蚧干预组有显著升高(P ＜0.05)，而黑斑蛤蚧干预组较生理盐水组有显著提高(P ＜0.05)。

表4 黑斑蛤蚧与地塞米松的疗效比较(±s)Tab.4 Comparison of therapeutic effects between blackspotted geckos and dexamethasone (±s)

表4 黑斑蛤蚧与地塞米松的疗效比较(±s)Tab.4 Comparison of therapeutic effects between blackspotted geckos and dexamethasone (±s)

注:与生理盐水组比较，* P ＜0.05;与黑斑蛤蚧干预组比较，ΔP ＜0.05

组别 动物数 (IFN-γ/IL-4) (IFN-γ/IL-5)黑斑蛤蚧干预组 10 22.30 ±4.96* 14.27 ±1.62*地塞米松干预组 10 30.44 ±9.16* Δ 20.77 ±5.86* Δ生理盐水组10 2.87 ±0.65 2.81 ±0.76

3 讨论

目前认为Th1/Th2 细胞平衡失调，机体正常的免疫耐受功能受损，从而导致免疫细胞及其成分对机体自身组织结构和功能的破坏，是哮喘发病的基础［7］。其失衡的程度与哮喘的发病关系密切。其中IFN-γ 及IL-4、IL-5 是调节Th1/Th2 细胞平衡重要细胞因子。IL-4 是Th2 细胞的特征性细胞因子，由Th0 细胞产生，诱导Th0 细胞向Th2 细胞转化［8］，并且可调控Th1 细胞向Th2 细胞分化［9］。IL-5 主要调节嗜酸性粒细胞生长、分化及其活性的细胞因子。研究表明，在小鼠气管内注入IL-5 可引起肺嗜酸性粒细胞明显增多及诱导气道增生或化生的黏液细胞凋亡增加［10］。IFN-γ 对IL-4 的拮抗作用可能是通过阻断GATA-3 的表达，抑制IL-4、IL-5 的合成从而降低体内IgE 的水平［11］。在哮喘发生时，高水平的IL-5 在IL-4 条件下可促使Th0细胞向Th2 分化，并且可间接抑制Th1 分泌IFNγ、IL-2 等炎症抑制因子，阻碍Th0 细胞向Th1 分化，造成Th1/Th2 的失衡而引发哮喘［12］。通过调节哮喘Th1 和Th2 细胞因子的平衡，从而逆转Th1/Th2 失衡或许是治疗哮喘的新途径。

目前，哮喘的治疗仍有争议，糖皮质激素治疗是目前公认的最有效的药物治疗，尤其是吸入糖皮质激素可下调气道上皮炎症因子的表达［13］。虽然效果明显，但是长期使用糖皮质激素治疗会产生严重的副作用。

本研究显示，黑斑蛤蚧对哮喘小鼠进行干预后，Th1 型细胞因子IFN-γ 水平显著升高，而Th2型细胞因子IL-4、IL-5 水平显著降低，并且IFN-γ和IL-4、IL-5 均呈现出负相关性，表明黑斑蛤蚧对哮喘模型小鼠外周血Th1/Th2 系统具有一定的免疫调节作用。同时研究数据也显示，地塞米松干预组与黑斑蛤蚧干预组相比较，黑斑蛤蚧下调IL-4和IL-5 水平和上调IFN-γ 水平的作用均不及地塞米松。黑斑蛤蚧药用部位是去除内脏的全身，中医认为具有助阳益精、补肺益肾、纳气定喘的功效。近年来许多研究表明，蛤蚧具有抗肿瘤、平喘、性激素样、抗炎等作用，本研究针对黑斑蛤蚧对哮喘模型的作用，初步探讨其作用机制。对蛤蚧在哮喘治疗中的免疫调节相关性还需作进一步探讨，明确其有效成分、剂量、疗效，为临床应用提供实验依据。

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