逍遥散对肝郁型拟阿尔茨海默病小鼠的影响

吴磊彬，邱昕，陈国华，魏丹，邵卫，李俐娟，张忠文，杨洁，吴潇，蔡薇娜，周晓香，熊晶

逍遥散对肝郁型拟阿尔茨海默病小鼠的影响

吴磊彬，邱昕，陈国华，魏丹，邵卫，李俐娟，张忠文，杨洁，吴潇，蔡薇娜，周晓香，熊晶

目的：观察逍遥散对慢性应激下拟阿尔茨海默病（AD）小鼠记忆能力和血清单胺类神经递质的影响。方法：将50只小鼠随机分为空白对照组﹑D-半乳糖组﹑复合模型组﹑逍遥散组﹑艾司西酞普兰组，每组10只。空白对照组给予生理盐水皮下注射，D-半乳糖组﹑复合模型组﹑逍遥散组﹑艾司西酞普兰组均皮下注射D-半乳糖溶液42 d造模。造模第29天开始，逍遥散组给予逍遥散灌胃，艾司西酞普兰组给予艾司西酞普兰灌胃，连续14 d；每日灌胃完成后，复合模型组、逍遥散组和艾司西酞普兰组均给予慢性束缚应激刺激，每天6 h，连续14 d。实验结束后，对各组进行避暗试验，并检测血清5-羟色胺（5-HT）和去甲肾上腺素（NE）含量。结果：避暗试验结果显示，与空白对照组和D-半乳糖组比较，复合模型组潜伏期缩短，错误次数增多；与复合模型组比较，逍遥散组和艾司西酞普兰组潜伏期延长，错误次数减少，逍遥散组和艾司西酞普兰组相比无明显差异。与空白对照组和D-半乳糖组比较，复合模型组5-HT和NE均明显降低；与复合模型组比较，逍遥散组和艾司西酞普兰组5-HT和NE均有升高，逍遥散组较艾司西酞普兰组升高更明显。结论：慢性束缚应激刺激联合D-半乳糖注射可成功建立肝郁型AD病证结合模型；逍遥散能明显改善此模型的记忆能力，且提升血清5-HT和NE的含量。

慢性束缚应激刺激；逍遥散；阿尔茨海默病；神经递质

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）亦称老年性痴呆，是威胁人体健康和社会人口素质的重大疾病。AD发病率与年龄高度相关，60岁左右人群的发病率为1%，之后约每5～6年翻一番[1]。我国AD的发病率已达4.8%[2]，且目前尚无有效疗法。国外研究表明，痴呆患者伴发抑郁的比率显著增高，约10%～20%的AD患者伴重度抑郁症[3]。临床工作中由于AD患者有认知功能障碍，抑郁症的诊断常被忽略，进而加重AD病情。因此，对于AD伴发抑郁的相关研究尤为重要。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级6周龄的雄性BALB/c小鼠50只，体质量（20±3）g，由武汉大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2008-0004。所有动物在温度（20±2）℃，湿度50%～60%，白昼/黑夜周期为12 h/12 h条件下适应环境5 d后开始实验。实验中除应激期间外均自由饮水及摄食。

1.1.2 药物 逍遥散按《方剂学》配制：柴胡9 g，当归9 g，白芍9 g，白术9 g，茯苓9 g，甘草4.5 g，薄荷少许，生姜一块。将上述中药于水中浸泡2 h，然后用8倍体积的水先武火加热煮沸，再用文火煎煮，待到药液剩1倍体积时装入容器，同法再用4倍体积的水煎煮至1倍体积，倒出药液，再用2倍体积的水煎煮至1倍体积，倒出药液，将3次煎煮的药液合在一起并过滤，最后用文火将逍遥散浓缩至0.81 g/mL的药液，装瓶后高压灭菌，灭菌后，在超净工作台上将药液分装于无菌离心管中，4℃冰箱保存备用，灌胃时每天取1支，避免污染。

1.1.3 主要试剂及仪器 去甲肾上腺素（noradrenaline，NE） 和 5-羟 色 胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）测试盒购于伊莱瑞特生物科技有限公司；D-半乳糖购于武汉梓杉生物技术有限公司；电热恒温水箱购于上海一恒科技有限公司；MK3型酶标仪购于热电（上海）仪器有限公司；紫外可见分光光度计（752-p）购于上海现科仪器有限公司；台式低温高速离心机（MR 23i）购于德国HERAUS公司；电热鼓风干燥箱购于北京永光明医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药 小鼠适应性饲养5 d后，根据体重随机分为5组：空白对照组﹑D-半乳糖组﹑复合模型组﹑逍遥散组和艾司西酞普兰组，每组10只，并用苦味酸标记分笼，每笼3～4只。空白对照组按10 mL/（kg·d）给予生理盐水颈背部皮下注射，D-半乳糖组﹑复合模型组﹑逍遥散组和艾司西酞普兰组均按120 mg/（kg·d）颈背部皮下注射D-半乳糖溶液造模，连续42 d。在造模第29天各组皮下注射打完后，空白对照组、D-半乳糖组和复合模型组按16 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，逍遥散组给予逍遥散13 g/（kg·d）灌胃，艾司西酞普兰组给予艾司西酞普兰10 mg/（kg·d）灌胃；每日灌胃完成以后，复合模型组﹑逍遥散组、艾司西酞普兰组均给予慢性束缚应激刺激，每天6 h，连续14 d。

1.2.2 慢性束缚应激刺激 慢性束缚装置按文献[4]所述，将50 mL离心管管壁不同部位钻出直径3 cm左右的小孔，以防止小鼠窒息。将小鼠头朝向管底放入离心管内后封闭管口，头端稍高于尾端放置，每天6 h,束缚期间禁食水，6 h后恢复自由，连续14 d，制备肝郁证小鼠模型。

1.2.3 避暗试验 避暗试验是反映小鼠记忆能力的较好的行为学试验之一，根据记忆形成的特点，当小鼠被反复置于相同环境和接受多次电刺激时，无疑会加强记忆的巩固。采用2个单独反射箱，每个箱大小为36 cm×12 cm×12 cm。测试开始时，使暗室铜栅通电，将小鼠头向明处放入反射箱中，系统记录其5 min内被电击次数，记录潜伏期（小鼠从明室第1次进入暗室的时间）和错误次数（小鼠从明室进入暗室的次数）。参照文献[5]，试验分为2天，第1天为小鼠适应期，以第2天的潜伏期和错误次数共同作为记忆成绩。

1.2.4 神经递质测定 小鼠麻醉后摘眼球取血，立即离心取上清液，并按说明书采用ELISA法测定5-HT、NE的含量。

1.3 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件处理数据，计量结果以（均数±标准差）表示，单因素方差分析，＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

避暗试验显示，与空白对照组和D-半乳糖组比较，复合模型组潜伏期缩短，错误次数增多；与复合模型组比较，逍遥散组和艾司西酞普兰组潜伏期延长，错误次数减少；逍遥散组和艾司西酞普兰组相比无明显差异，见表1。与空白对照组和D-半乳糖组比较，复合模型组5-HT和NE均明显降低；与复合模型组比较，逍遥散组和艾司西酞普兰组5-HT和NE均有升高，逍遥散组较艾司西酞普兰组升高更明显，见表1。

表1 各组小鼠避暗实验及5-HT﹑NE测定结果（±s）

表1 各组小鼠避暗实验及5-HT﹑NE测定结果（±s）

注：与空白对照组比较，①＜0.05,②＜0.01；与D-半乳糖组比较，③＜0.01；与复合模型组比较，④＜0.01

组别 例数 潜伏期/s空白对照组 10 182.9±36.34 D-半乳糖组 10 143.8±28.41①复合模型组 10 97.9±25.98②③逍遥散组 10 240.3±36.17④艾司西酞普兰组 10 210.8±34.63④错误次数/次1.4±0.52 3.8±1.47①4.7±1.88②③1.5±0.45④1.6±0.54④5-HT/(ng/mL) 32.201±2.570 27.903±2.692①24.201±1.389②③29.251±3.272④30.713±2.957④NE/(pg/mL) 236.86±19.85 190.29±13.81①142.70±13.48②③184.19±18.33④196.37±17.45④

3 讨论

D-半乳糖致亚急性衰老模型常用来模拟AD模型，其实验周期短、个体差异小、重现性稳定、方法可靠[6]。本研究采用慢性束缚应激刺激联合D-半乳糖注射建立肝郁证AD病证结合模型，并用疏肝解郁代表方逍遥散进行干预。辨证论治是中医的基本思想，证候是疾病发展过程中某一阶段机体的病理变化的概括，是机体对外界各种致病因素作出反应的一种功能状态，是中医学认识疾病和辨证论治的主要依据。证是一个非线性的“内实外虚”“动态时空”和“多维界面”的复杂巨系统[7]，作为一种有规律的病理表现或功能表现，必然有支配它的物质结构，即有诸于内，必形于外，内在物质结构是外在功能表现的基础。因此，本研究观察逍遥散对肝郁证AD病证结合动物的学习记忆力和血清单胺类神经递质的影响。

5-HT是中枢神经系统的传递物质，广泛存在于脑、血小板、胃等组织，是较强的平滑肌刺激和血管收缩剂。它在血小板中含量较高，血小板破裂释放后参与血管收缩等。NE主要由交感节后神经元和脑内肾上腺素能神经末梢合成和分泌，是后者释放的主要递质。血清5-HT等神经递质含量较低是AD的重要危险因素之一[8,9]。也有研究表明，5-HT、NE等神经递质减少及失平衡可能是AD患者常伴有精神行为症状的有关主要因素之一，神经内分泌紊乱也是其发病的可能因素[10,11]。避暗试验是利用小鼠或大鼠具有趋暗避明习性设定的装置，能较好地反映小鼠的记忆能力。本研究证明，逍遥散能较好地改善肝郁证AD模型小鼠记忆能力及神经递质活性，对AD有较好的防治作用，与文献[12,13]报导相符，确立了AD从肝论治的科学性及“调肝”治法的有效性。

综上所述，慢性束缚应激刺激联合D-半乳糖注射可成功建立肝郁型AD病证结合模型，逍遥散能明显改善此模型动物的记忆能力，且提升血清神经递质5-HT和NE的含量。

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Effects of Xiaoyaosan on Mice Model of Alzheimer's Disease with Stagnation of Liver-QI

Objective:To observe effects of Xiaoyaosan on the memory ability and neurotransmitters expression in Alzheimer's disease(AD)mouce model with chronic mild stress.Methods:Fifty mice were randomly divided into five groups:blank group,D-Gal group,compound group,Xiaoyaosan group and Escitalopram group,with 10 mice in each group.The blank group was injected with normal saline,and the others were injected with D-gal for 42 days.From the twenty-ninth day,the mice in the Xiaoyaosan group were intragastrically administrated with Xiaoyaosan,and in the Escitalopram group with escitalopram.After the intragastric administration,the mice in both the Xiaoyaosan and Escitalopram groups were subjected to chronic stress for 6 hours each day,lasting for 14 days.Then Dark evading test and NE and 5-HT levels in all the mice were evaluated.Results:Compared to the groups of blank and D-gal,the escape latency time in the compound group was shortened and error times were increased in the Dark evading test,while the 5-HT and NA levels were decreased markedly.Compared to the compound group,the escape latency time in the Xiaoyaosan and Escitalopram groups were prolonged and error times were reduced,while 5-HT and NA were increased.Conclusion:Chronic mild stress and D-gal combination can be used to establish AD mouce model with stagnation of liver-QI.Xiaoyaosan can improve memory function and increase the serum 5-HT and NE levels in AD mice.

chronic mild stress;Xiaoyaosan;Alzheimer's disease;neurotransmitter

R741;R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.009

武汉市中西医结合医院神经内科武汉 430022

湖北省卫生厅青年科技人才基金（No.QJX2010-44）；湖北省自然科学基金（No.2011CDB298）

2014-02-10

邱昕415687305@qq.com