高血压脑出血模型大鼠不同时间段脑损伤程度与NO 含量和C9 表达的关系

徐 莉

(武汉市中南干休所医务室，湖北 武汉 430071)

近年来的研究表明脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后血肿四周存在明显的炎症反应，炎症反应在脑出血继发性脑损伤中起着十分重要的作用［1］。研究发现，补体系统在脑损伤炎症反应过程中起着重要作用［2］。本实验通过观察不同时间段高血压脑出血大鼠脑组织含水量、脑组织C9 表达和NO 水平，以探讨其与脑损伤程度的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物分组与造模

大鼠由湖北省动物实验中心提供，合格证号:SCXK(鄂)2011～012;分组:将96 只大鼠随机分为均等的3 部分(每部分32 只)，分别用于脑组织含水量测定、脑组织NO 水平测定和C9 表达检测。每部分又随机分为假手术组、模型组共2组，每组16 只;每个小组16 只大鼠再4 个为一组，分别观察术后2h、12、24、72h 四个时间点各项指标，各组饲养条件相同。

高血压模型及脑出血模型的制备是通过应用双肾双夹法来复制肾性高血压大鼠(RHR)模型。剔除饲养过程期间出现脑卒中症状和体征的大鼠。双肾双夹术后2～3 月体质量300～350g/只的高血压大鼠参照Rosenberg［3］的方法，术前禁食，可自由饮水，大鼠用戊巴比妥(0.1ml/100g)注射液腹腔麻醉后俯卧位固定于立体定位仪上，据图谱调整立体定位仪于注射点，头皮正中常规消毒后矢状位切开约1.5cm，暴露前囟点，用骨钻钻颅打孔(直径约1mm)后，用微量进样器吸取胶原酶2μl 迅速插入钻好的孔内，进针5mm，注射时间不少于15min，且留针10min 后缓慢退针，钻孔处用骨蜡封闭，局部消毒后，缝合皮肤。

1.1.2 药品与仪器

注射用尿激酶(03290，南京南大药业有限责任公司)，配制成200IU/L 的溶液;兔抗大鼠C9 免疫组化试剂盒(上海恒远生化试剂有限公司);NO试剂盒来自南京建成生物工程研究所。仪器:大鼠脑立体定位仪，微量注射仪购于北京智鼠多宝生物科技有限责任公司;电子天平(SARTOR2US，BP211D)，德国生产;8021 离心机(上海手术器械厂);752 分光光度仪(上海精密仪器仪表有限公司);半自动免疫组化仪(常州市郝思琳医用仪器有限公司);计算机病理图像管理系统4.10(北航图像中心)。

1.2 方法

分别于术后第2、12、24 及72h，用10%水合氯醛麻醉大鼠后，迅速取出全脑，并用滤纸吸干脑表面液体和血迹，一部分置于中性福尔马林内固定作HE 染色和免疫组化染色。另一部分用于脑组织含水量测定。

1.2.1 脑组织含水量测定［4］

将样本小塑料封口袋密闭，置-20 ℃冰箱内5～10 min 微冻硬后取出，置于薄膜隔开的干冰上，用薄刀片切取离胶原酶注入点4mm 以外的2mm 厚冠状脑片，分离出血侧皮质及基底节，置浓硫酸处理过的称量杯内。用电子天平称取湿重后，置小玻璃瓶中，再放入105℃烤箱内烘烤24～48h，直到称重为恒重。根据Eliott 公式可以计算脑组织含水量(Water Content，WC)

1.2.2 脑组织C9 表达测定

分别于第2、12、24、72h 手术，取脑组织，固定:C9 着色于细胞浆和细胞膜。采用兔抗大鼠C9 免疫组化试剂合，按试剂盒要求检测。在免疫组化阳性细胞胞浆及胞膜可见棕黄色颗粒。紧贴血肿周围但不包括血肿区切片，每张切片随机取4 个不重复高倍视野(400 倍)，计数每个高倍视野下阳性细胞数。所有切片均在同等强度下、同等放大倍数下分析，取每一时间点高倍视野下的阳性细胞数平均数，结果用表示。

1.2.3 NO 测定

分别于第2、12、24、72h 手术，微冻硬后取出，置薄膜隔开的干冰上，分离出血侧皮质及基底节，4℃下用预冷的匀浆介质制备成10%的脑匀浆置3000r/min 离心15min 后，取脑匀浆上清液，按硝基还原酶法测定NO 的含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 大鼠脑组织含量变化

从表1 可见，与假手术组相比，ICH组脑组织含水量从2h 开始增加，12h 增加较为明显(P ＜0.05)，24～72h 增加最明显(P ＜0.01)。

表1 大鼠脑组织含水量(，%)

表1 大鼠脑组织含水量(，%)

与假手术组比较，* P ＜0.05、＊＊P ＜0.01

2.2 大鼠脑组织C9 表达结果

脑出血后2h 血肿周围可见少量C9 表达，阳性细胞为小胶质细胞(P ＞0.05)，脑出血后12h增加明显，24h 达到高峰(P ＜0.01)，主要为小胶质细胞和少量的神经元细胞，血管内皮细胞亦可表达，一直持续到72h。可见，脑出血后24～72h，C9 的表达处于高峰，与假手术组比较有显著性差异。见表2。

表2 大鼠脑组织补体C9 表达(，个)

表2 大鼠脑组织补体C9 表达(，个)

与假手术组比较，* P ＜0.05、＊＊P ＜0.01

2.3 大鼠脑组织中NO 含量的结果

与假手术组比较，ICH组大鼠2h 脑组织NO含量已有下降，12h 已有显著性差异(P ＜0.05)，24～72h 处于低水平(P ＜0.01)。

表3 大鼠脑组织NO 含量的变化(，μmol/L)

表3 大鼠脑组织NO 含量的变化(，μmol/L)

与假手术组比较，* P ＜0.05、＊＊P ＜0.01

3 讨论

在脑出血的病理发展过程中，脑组织继发性损伤是脑出血病情加重、预后不良的重要因素［5］。出血性脑损伤的炎性反应，由白细胞粘附血管壁，血-脑屏障遭破坏、炎性细胞侵入脑实质等组成。脑出血时炎性因子表达增加，能增加脑水肿、血管壁通透性。NO 是由血管内皮细胞分泌的强有力的血管舒张因子，可以直接作用于平滑肌细胞，通过激活鸟苷酸环化酶，使细胞内的游离钙水平降低，平滑肌松弛。脑部血流是由内皮衍生的NO调节的，NO 还是红细胞聚集性的重要影响因素［6］。NO 可通过抑制白细胞-内皮细胞粘附、阻止血小板凝集和疏通组织灌注等限制缺血性脑损伤［7］。本实验中与假手术组比较，ICH组大鼠2h脑组织NO 含量已有下降，12h 已有差异(P ＜0.05)，24～72h 处于较低水平(P ＜0.01)，说明脑出血急性期NO 下降是导致红细胞聚集，进而溶解破裂、血肿形成的重要因素，因而治疗中改善微循环是重要环节。脑出血后脑水肿主要分为血管源性脑水肿和细胞毒性脑水肿，血管源性脑水肿常发生于脑出血早期，它的形成原因主要有血管壁通透性增加、血管损伤、血浆外渗及血脑屏障破坏［8］。脑出血后补体级联被激活，C9 表达增加，补体C9-C5b组成膜攻击复合物(MAC)，MAC 是大分子复合物，可形成跨膜孔道使大分子物质和离子双向流动，进而攻击神经胶质细胞、神经细胞和血肿内的红细胞，加剧ICH 后脑损伤，MAC 也可直接插入星形胶质细胞、神经元和内皮细胞，破坏血脑屏障。实验表明脑出血后24～72h，C9 的表达处于高峰，说明在脑出血后脑水肿尤其在血管源性脑水肿中补体系统对于其发展起着重要作用。

［1］聂亚雄，王东，张雄，等.三七总皂苷注射液对脑出血大鼠脑水肿的影响［J］.中国中西医结合杂志，2006，26(10):922

［2］Hua Y，Xi G，Keep RF，et al.Complement activation in the brain after experimental intracerebral hemorhage［J］.J Neurosurg，2000，92(6):1016

［3］Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Kornfeld M，et al.Colla-genase induced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1990，21(5):801

［4］Guohua Xi，Ya Hue，Keep RF，et al.Activation of p44/42 mitogen activated protein kinase in thrombin-induced brain tolerance［J］.Brain Res，2001，(895):153

［5］Keep RF，Xi G，Hua Y，et al.The deleterious or beneficial effects of different agents in intracerebral hemorrhage:think big，think small or is hematoma size important［J］.Stroke，2005，36(7):1594

［6］Beridze M，Momtsehdze N，Shakarishvili R，et al.Effect of nitric oxide initial blood levels on erythroeyte aggrega-bility during 1 2 houm from ischemic stroke onset［J］.Clinical Hemorheology and Microcirculation，2004，30:403

［7］Cosentino F，Rubaattu S，Savoia C，et al.Endothelial dysfunction and stroke［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2001，38(Suppl 2):75

［8］Nakam ura T，Xi G，Park JW，et al.Holo-transferrin and thrombin can interact to cause brain dam age［J］.Stroke，2005，36(2):348