阳春砂多糖的分离纯化及体外抗氧化作用研究

李世杰，张丹雁，严娅娟，曹 曼

广州中医药大学中药学院，广州 510006

阳春砂来源于姜科豆蔻属植物阳春砂(Amomum villosum Lour.)的干燥成熟果实，是我国著名的“四大南药”之一。具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎的功效，临床上主要用于湿浊中阻、脘痞不饥、脾胃虚寒、呕吐泄泻、妊娠恶阻、胎动不安等症［1］。

近年来，大量学者从植物、微生物中提取多糖并进行相关药理研究，取得了巨大的成果。目前研究表明，多糖具有抗炎、抗氧化、抗癌、调节免疫、降低血压等功效［2-6］。然而，阳春砂多糖(Amomum villosum polysaccharides，以下简称AVP)的药理活性研究还尚未见报导，目前针对阳春砂的药理研究主要集中在其水提液及挥发油研究上，单纯研究水提液的药理作用不能阐明其具体作用机制，无法给出合理科学的解释，而阳春砂水提液中主要成分为水溶性多糖，因此，对AVP 初步药理活性研究具有重要的现实意义。本文以AVP 及其纯化组分为研究对象，比较其对超氧阴离子自由基、羟自由基及二苯代苦味肼基自由基的清除作用，以了解AVP 抗氧化作用活性，为阳春砂的开发提供参考依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

阳春砂，采自阳春市砂仁种植场，样品经广州中医药大学中药鉴定教研室张丹雁教授鉴定为姜科植物阳春砂Amomum villosum Lour.的干燥成熟果实;乙醇(AR，上海久亿试剂公司)，硫酸(AR，上海久亿试剂公司)，正丁醇(AR，南京试剂公司)，氯仿(AR，南京试剂公司);DEAE-纤维素-52 凝胶、SephadexG-100 凝胶、葡聚糖标准品、1，1-二苯基苦基苯肼、菲咯嗪、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、吩嗦硫酸甲酯(PMS)、还原型辅酶I(NADH)、三吡啶吖嗪(TPTZ)购于Sigma 公司;其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

KQ-400KDE 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);FA2004 电子天平(上海恒平科学仪器有限公司);501-A 型超级恒温器(上海实验仪器厂有限公司);DL-6000B 离心机(上海安亭科学仪器厂);UV-360 紫外可见分光光度计(日本岛津公司);DHL-2B 型电脑数显恒流泵、DBS-100A 型电脑全自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂);层析柱(2.6 ×30 cm，2.6 ×60 cm，上海亚荣生化仪器有限公司);Alphal-2 型冷冻干燥机(英国LABCONCO 公司);Re-52AA 型旋转蒸发仪(金坛市玻璃实验厂)。后得到三个主要组分，分别为纯水洗脱的组分Fl、0.1 mol/L NaCl 溶液洗脱的组分F2和0.3 mol/L NaCl 溶液洗脱的组分F3。

图1 AVP DEAE-纤维素-52 色谱柱洗脱曲线图Fig.1 DEAE-cellulose-52 column elution curve of AVP

2 方法与结果

2.1 AVP 分离纯化

2.1.1 AVP 样品制备

采用水提醇沉法［7］得到粗多糖AVP 样品。

2.1.2 离子交换色谱法初步分离

称取60 mg AVP 粗多糖溶于3 mL 去离子水中，加样于DEAE-纤维素-52 层析柱(2.6 ×30 cm)中，用0.0、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl 溶液依次梯度洗脱，流速1.0 mL/min，分步收集(10 min/管)，每梯度20 管，硫酸-苯酚法检测各管多糖含量(490 nm处吸收值)，收集不同洗脱梯度相应的组分。合并相同组分，50 ℃旋转蒸发浓缩，去离子水透析48 h以去除NaCl 及小分子杂质，最后将透析液真空冷冻干燥，得初步纯化产品。同时以收集的管数为横坐标、吸光值(490 nm)为纵坐标绘制DEAE-纤维素-52 色谱柱洗脱曲线，洗脱曲线见图1。由图1 可以看出，阳春砂多糖经DEAE-纤维素-52 层析柱分离

2.1.3 葡聚糖凝胶色谱法进一步纯化

分别称取10 mg 经DEAE-纤维素-52 初步纯化的各多糖组分，溶于5 mL 去离子水中，加样于Sephadex G-l00 层析柱(2.6 ×60 cm)中，用去离子水洗脱，流速0.25 mL/min，分步收集(10 min/管)。硫酸-苯酚法检测各管多糖含量(490 nm 处吸收值)，分别收集不同的组分。合并相同组分，50 ℃减压蒸发浓缩，去离子水透析48 h 以去除小分子杂质，最后将透析液真空冷冻干燥，得纯化产品用于进一步的分析。同时以收集的管数为横坐标、吸光值(490 nm)为纵坐标绘制Sephadex G-100 色谱柱洗脱曲线，洗脱曲线见图2。从图2 可以看出，初步分离的三个组分(F1、F2和F3)经葡聚糖G-100 凝胶柱分离后各得一个纯化组分，分别命名为AVP-1、AVP-2 和AVP-3。多糖组分由于存在糖醛酸、硫酸基等一些荷电基团，因此要想获得纯多糖，通常先按照离子强度的不同进行初步分离，得到电荷单一的组分，然后再通过分子量的不同进行第二次分离获得电荷和分子量均单一的多糖。本实验通过离子交换层析和凝胶过滤层析纯化阳春砂多糖，得到了三个纯化组分(AVP-1、AVP-2 和AVP-3)，用于进一步的分析。

图2 AVP Sephadex G-100 色谱柱洗脱曲线图Fig.2 Sephadex G-100 column elution curves of AVP

2.2 AVP 抗氧化实验

2.2.1 多糖对超氧阴离子自由基(O-·2)的清除作用

采用超氧阴离子自由基体系［8］，观察多糖对的清除作用。取不同浓度的AVP 样品(粗AVP、AVP-1、AVP-2 和AVP-3)及维生素C 溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及5.0 mg/mL)1.0 mL 于试管中，分别加入1.0 mL NBT 溶液(156 μmol/L)、1.0 mL NADH 溶液(468 μmol/L)和1.0 mL PMS 溶液(60 μmol/L)。混匀反应体系，25 ℃水浴5 min，于560 nm 波长处测吸光度。NBT 溶液、NADH 溶液及PMS 溶液都是用0.1 M pH=7.4 的磷酸盐缓冲液配制。以水代替AVP、维生素C 溶液;0.1 M pH=7.4 磷酸盐缓冲液代替NBT 溶液，作空白实验调零用。每个试样做3次平行试验取平均值。清除率计算公式为:

式中:A0为对照实验(水代替AVP、维生素C溶液)的吸光度;A1为样品实验的吸光度;A2为样品干扰实验(0.1M pH=7.4 磷酸盐缓冲液代替NBT 溶液)的吸光度。

不同浓度的AVP 对超氧阴离子自由基的清除作用结果见图3。由图3 可知，AVP 及其纯化组分AVP-1、AVP-2、AVP-3 对自由基清除活性呈一定的量效关系。AVP-3 清除活性稍高于粗AVP、AVP-1 及AVP-2。当浓度高于1 mg/mL 时，多糖清除活性优于阳性对照品维生素C。

图3 阳春砂多糖及其纯化组分(AVP-1、AVP-2、AVP-3)清除活性Fig.3 Scavenging effects of AVP and its purified fractions(AVP-1，AVP-2 and AVP-3)on superoxide radical

2.2.2 多糖对羟基自由基(·OH)的清除作用

羟基自由基清除活性的测定参照Yang 等［9］报道的方法稍作修改。取不同浓度的AVP 样品(粗AVP、AVP-1、AVP-2 和AVP-3)及维生素C 溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及5.0 mg/mL)溶液1.0 mL 于试管中，分别加入2.4mL 磷酸盐缓冲液(0.1M pH=7.4)和0.6 mL H2O2溶液(40 mmol/L)。混匀反应体系，10 min 后于分光光度计230 nm处测吸光度，以水代替AVP、维生素C 溶液和H2O2溶液，作空白实验调零用。每个试样做3 次平行试验取平均值，清除率计算公式同式1。

不同浓度的AVP 对羟基自由基的清除作用结果见图4。由图4 可知，AVP 及其纯化组分对·OH自由基具有明显的清除活性。AVP-3 清除·OH 自由基活性最强，当其浓度达到3.0 mg/mL 时，对·OH自由基清除率为68.2%。但是AVP 及其纯化组分对·OH 自由基清除活性比阳性对照品要弱。

图4 阳春砂多糖及其纯化组分(AVP-1、AVP-2、AVP-3)清除·OH 活性Fig.4 Scavenging effects on hydroxyl radical of AVP and its purified fraction (AVP-1，AVP-2 and AVP-3)

2.2.3 多糖对1，1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)

DPPH·自由基清除活性的测定参照Li 等［3］报道的方法稍作修改。取不同浓度的AVP 样品(粗AVP、AVP-1、AVP-2 和AVP-3)及维生素C 溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及5.0 mg/mL)1.0 mL 于试管中，分别加入0.2 mL DPPH 溶液(0.4 mmol/L)，再加入2.0 mL 水。混匀反应体系，30 min 后于波长517 nm 处测吸光度。DPPH 溶液用无水乙醇配制。以水代替AVP、维生素C 溶液，无水乙醇代替DPPH溶液，作空白实验调零用。每个试样做3 次平行试验取平均值。清除率计算公式同式1。

图5 阳春砂多糖及其纯化组分(AVP-1、AVP-2、AVP-3)清除DPPH·活性Fig.5 Scavenging effects of AVP and its purified fraction(AVP-1，AVP-2 and AVP-3)on DPPH radical

不同浓度的AVP 对DPPH·的清除作用结果见图5，图5 表明AVP 及其纯化组分对DPPH·都具有一定的清除活性。AVP-1 对DPPH·的清除作用最弱，AVP-3 清除活性最强;当浓度达到5 mg/mL时，AVP-3 对DPPH·的清除作用基本与阳性对照品相同。

3 结论

植物来源的多糖类化合物拥有免疫调节、抗肿瘤活性以及降血糖、降血脂活性和抗氧化等的独特功能，而且大多数毒性较小，在预防疾病上优于其他化合物，因此其应用具有广阔的前景。本实验以阳春砂粗多糖AVP 及纯化后的组分AVP-1、AVP-2、AVP-3 为研究对象进行抗氧化活性研究，确证了阳春砂多糖具有抗氧化的作用，它们具有很好的清除超氧阴离子自由基()、羟基自由基(·OH)及1，1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)活性，AVP-3比粗AVP、AVP-1 及AVP-2 具有更强的体外抗氧化活性。AVP 及其纯化组分对超氧阴离子自由基)清除活性要显著优于维生素C。阳春砂多糖的药理活性目前尚未有深入研究，本实验为阳春砂相关药品及食品研究开发提供的新的研究思路，为阳春砂的开发利用提供一定的理论依据。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission (国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中华人民共和国药典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，236.

2 Ukai S，Kiho T，Hara C，et al.Polysaccharides in fungi.XIV.Anti-inflammatory effect of the polysaccharides from the fruit bodies of several fungi.J Pharmacobio-Dynam，1983，6:983-990.

3 Li X，Zhou A，Han Y.Anti-oxidation and anti-microorganism activities of purification polysaccharide from Lygodium japonicum in vitro.Carbohyd Polym，2006，66:34-42.

4 Topping DL.Soluble fiber polysaccharides:effects on plasma cholesterol and colonic fermentation.Nutr Rev，1991，9:195-203.

5 Kiho T，Оокив K，Usui S，et al.Structural features and hypoglycemic activity of a polysaccharide (CS-F10)from the cultured mycelium of Cordyceps sinensis.Biol Pharm Bull，1999，22:966-970.

6 Gamal-Eldeen AM，Ahmed EF，Abo-Zeid MA.In vitro cancer chemopreventive properties of polysaccharide extract from the brown alga，Sargassum latifolium.Food Chem Toxicol，2009，47:1378-1384.

7 Zhang D，Li S，Xiong Q，et al.Extraction，characterization and biological activity of polysaccharides from Amomum villosum.Carbohyd Polym，2013，95:113-122.

8 Xu R，Ye H，Sun Y，et al.Preparation，preliminary characterization，antioxidant，hepatoprotective and antitumor activities of polysaccharides from the flower of tea plant (Camellia sinensis).Food Chem Toxicol，2011，50:2473-2480.

9 Yang B，Zhao M，Shi J，et al.Effect of ultrasonic treatment on the recovery and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from longan fruit pericarp.Food Chem，2008，106:685-690.