天然牛磺酸对肝硬化大鼠MMP-9、Integrin-β1 表达的调控

文 彬，陈 然，彭佩纯，邓 鑫

广西中医药大学附属瑞康医院，南宁 530011

肝硬化的形成是一个多因素、多环节、多途径的病理损伤过程。MMP-9 是基质金属蛋白酶(MMPs)家族类重要成员，可以水解沉积的细胞外基质(ECM)。整合素作为跨膜信号分子，介导细胞与细胞外基质黏附，通过激活多种信号分子，导致细胞生物学行为改变［1］。越来越多证据表明细胞外基质的合成、降解功能失衡［2］及整合素介导的细胞外基质-整合素-细胞骨架黏附网络系统可以调控肝星状细胞的增殖与凋亡，在肝纤维化形成中发挥重要作用［3］。天然牛磺酸是名贵中药“牛黄”的有效成分之一，前期的实验研究发现天然牛磺酸具有较好的抗肝纤维化作用［4］。本研究通过荧光定量PCR、免疫蛋白印迹法探讨天然牛磺酸对肝硬化大鼠MMP-9、Integrin-β1 表达的影响，旨在为进一步揭示天然牛磺酸抗肝硬化的作用机制提供依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SD 大鼠，SPF 级，6～7 周龄，雄性，体重(170 ±20)g，广西医科大学动物实验中心提供，动物合格证:scxk 桂2009-0002。

1.2 主要试剂及仪器

天然牛磺酸从乌蛤肉提取，采用热水提取法［5］，红外光谱仪鉴定产品质量;四氯化碳(CCl4)，分析纯，购于天津富宇精细化工试剂厂产品;食用酒为北京方庄酒厂提供;食用橄榄油(西班牙贝蒂斯);肝纤四项放射免疫分析测定盒(上海海军医学研究所生物技术中心产品);总RNA 提取试剂盒(K0731)、逆转录试剂盒(K1622)、荧光扩增试剂盒(k0222)均由(加拿大Fermentas 公司)提供;鼠抗单克隆Integrin β1 抗体(英国Abcam 公司，货号:ab52971)、鼠抗单克隆MMP9 抗体(英国Abcam 公司，货号:ab76003);HRP 标记的二抗(美国Bio-rad公司，批号:172-1011);PVDF 膜(美国Millipore 公司，批号:IPVH00010);超微量分光光度计(美国Qμawell，Q5000);荧光定量PCR 仪(美国ABI 公司，ABI Stepone Plus)。

2 实验方法

2.1 模型制备

采用复合因素法［6］制备肝硬化大鼠模型，大鼠首次以0.5 mL/100 g 皮下注射(橄榄油60% +40%CCl4)混合液，以后每隔3 日按0.3 mL/100 g 体重皮下注射，每周2 次;15%酒精为唯一饮料，0.5%胆固醇、20%猪油、79.5%玉米面的高脂饲料喂养，满10 周时随机抽取5 只大鼠行肝脏病理学检测;正常组则以普通饲料和纯净水喂养。

2.2 动物分组

75 只SD 大鼠适应性饲养1 周后，随机分为对照组、模型组、天然牛磺酸高、中、低剂量组，每组各15 只。正常对照组不经造模处理，从实验第1 d 开始，给予相同剂量的生理盐水皮下注射;模型组给药方法同模型制备;天然牛磺酸治疗组在造模成功后，按高中低(1.2、0.6、0.3g/kg·d)剂量灌胃，每天一次，连续60 d，直至实验结束;模型组及对照组大鼠给与相同剂量生理盐水灌胃。

2.3 血清肝纤维四项指标测定

血清HA、LN、IV、PCIII 的检测采用放射免疫法，严格按试剂盒步骤操作。

2.4 实时荧光定量PCR 检测MMP-9、Integrin-β1 mRNA 的表达

各基因引物序列如下:MMP-9 上游:AAGGTCGCTCGGATGGTTAT，下游:AGTTGCCCCCAGTTACAGTG;Integrin-β1 上 游:TTGCCTTGCTGCTGATTTGG，下游:AGTTGTCACGGCACTCTTGT;GAPDH 上 游:TGACTCTACCCACGGCAAGT，下 游:TACTCAGCACCAGCATCACC。取新鲜肝脏组织，应用TRlzol 法抽提总RNA，超微量分光光度计测定OD260/280 吸光值，计算总RNA 含量及纯度。严格按照逆转录试剂盒(K1622)将RNA 逆转录成cDNA后进行扩增反应。以GAPDH 为内参基因，QPCR 体系配置(20 μL):2 ×Master Mix 10 μL，Forward Primer(10 mM)0.8 μL，Reverse Primer(10 mM)0.8 μL，cDNA 0.8 μL，Water nuclease-free 7.6 μL。QPCR 反应条件:Integrin-β1 反应条件:95 ℃预变性5 min;95℃15s 变性，62 ℃1 min 退火，扩增35个循环;最后72 ℃延伸7 min。MMP-9 反应条件:94 ℃预变性4 min 后，以94 ℃变性40 s，60 ℃退火35 s，共40个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR 反应结果数据采用2-△△CT进行相对定量比较。

2.5 免疫蛋白印迹检测MMP-9、Integrin-β1 蛋白的表达

采用免疫蛋白印迹技术，取100 mg 新鲜肝组织加裂解液(50 mmoL/L Tris-HCL pH 7.2，0.15mol/L NaCl，1%NP-40，1%SDS，5 mmoL/L EDTA，1 mmoL/L PMSF)充分裂解，4 ℃，12000 rpm 离心10 min，取上清提取肝组织总蛋白，测定总蛋白浓度。取40 μg 总蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白转移至PVDF 膜上，经5%脱脂奶粉溶液封闭后，分别加入一抗MMP-9(1∶100)、integrin-β1(1∶500)，抗体4 ℃孵育过夜，洗涤后以偶联HRP 标记的二抗(1∶5000)结合反应，ECL 显影曝光，GAPDH 为内参，Quantity One 软件半定量分析特异性条带灰度值，与内参灰度值的比值为蛋白相对含量。

2.6 统计学方法

应用SPSS 17.0 统计软件进行分析，计量数据用均数±标准差()表示，多组间指标的检测采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 大鼠一般情况

正常对照组大鼠一般情况好，皮毛色泽光滑、柔顺;模型组大鼠精神萎靡，易惊恐烦躁，体重减轻，皮毛色泽无光滑，造模期间死亡4 只，随机抽取的5 只大鼠肝脏病理学检测均提示肝硬化模型制作成功;天然牛磺酸治疗组大鼠皮毛柔顺，体重增加，精神状况明显改善，治疗期间无死亡。

3.2 天然牛磺酸对大鼠血清肝纤四项的影响

与对照组相比，模型组大鼠血清HA、LN、IV-C和PCIII 水平显著升高(P＜0.05);与模型组相比，天然牛磺酸各剂量组HA、LN、IV-C 和PCIII 均明显降低(P＜0.01);中、高剂量组降低HA、LN、IV-C和PCIII 水平明显优于低剂量组(P＜0.05)，中、高剂量组间比较差异无统计学意义(P ＞0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠血清肝纤维化指标比较()Table 1 Indices of serum liver fibrosis in rats()

表1 各组大鼠血清肝纤维化指标比较()Table 1 Indices of serum liver fibrosis in rats()

注:NT 代表天然牛磺酸，与对照组比较，△P＜0.01;与模型组比较，★P＜0.01;与中剂量组比较，○P ＞0.05。Note:NT-Natural Taurine，Compare with control，△P＜0.01;Compare with Model，★P＜0.01;Compare with NT-M，○P ＞0.05.

图1 GAPDH、MMP-9、Integrin-β1 扩增和溶解曲线图Fig.1 Amplification and meltcurves of GAPDH，MMP-9，Integrinβ1

3.3 RNA 纯度及PCR 扩增曲线

提取总RNA 用超微量分光光度计测定OD260/280 吸光值在1.8～2.0 之间，RNA 纯度符合扩增要求。GAPDH、MMP-9、Integrin-β1 实时荧光定量PCR扩增曲线呈S 型，基线平滑，将检测临界点定在CT值，即PCR 产物进入指数增长期的起始点。产物熔解曲线呈锐利的单一峰，熔解温度(Tm)均一，说明PCR 产物特异性高，无杂带(见图1)。

3.4 天然牛磺酸对大鼠肝组织MMP-9、Integrinβ1 mRNA 的表达水平影响

以相对定量法2-△△CT值［7］比较各组大鼠MMP-9、Integrin-β1 mRNA 表达水平，发现模型组MMP-9、Integrinβ1 mRNA 表达水平明显高于正常对照组;天然牛磺酸低剂量组MMP-9、Integrin-β1 mRNA 表达降低，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，天然牛磺酸中高剂量组MMP-9、Integrin-β1 mRNA表达降低尤明显，与模型组比较差异非常显著(P＜0.01)。(见图2)。

图2 各组大鼠肝组织MMP-9、Integrin-β1 mRNA 表达水平比较Fig.2 MMP-9，Integrin-β1 mRNA expression level in different groups

3.5 天然牛磺酸对肝硬化大鼠MMP-9、Integrin-β1蛋白表达的调控

各组大鼠肝组织MMP-9、Integrin-β1 与内参GAPDH 平均灰度值比值分别为:正常组(4.1 ±1.0，2.2 ±0.6)，模型组(9.0 ±1.9，5.0 ±1.1)，高剂量组(4.4 ±1.1，2.4 ±0.7)，中剂量组(4.3 ±1.1，2.4±0.8)，低剂量组(6.1 ±1.3，3.6 ±0.9)。与正常组相比，模型组大鼠肝组织MMP-9、Integrin-β1 蛋白表达明显增加(P＜0.01);天然牛磺酸各剂量组可以显著降低模型组MMP-9、Integrin-β1 蛋白表达，差异均有统计学意义(P＜0.01);中剂量组降低MMP-9、Integrin-β1 蛋白表达明显优于低剂量组(P＜0.01)，与高剂量比较差异无统计学意义(P ＞0.05)(见图3)。

图3 各组大鼠MMP-9 蛋白(A)、Integrin-β1 蛋白(B)表达水平Fig.3 MMP-9(A)andIntegrin-β1(B)protein expression levels in different groups of rats

4 讨论

肝硬化目前尚缺乏良好的治疗手段，中医中药在此方面具有广阔前景，天然牛磺酸是名贵中药“牛黄”的有效成分之一，也是多种中药的有效成分，海洋生物如乌蛤、珍珠母、牡蛎、海藻等含有丰富的天然牛磺酸，现代药理学研究表明［8，9］:天然牛磺酸具有解毒护肝，抗氧化损伤，抗肿瘤及增强机体免疫功能等活性。我们的前期研究也证实天然牛磺酸可以通过减轻肝细胞炎症反应，降低脂质过氧化而达到抗纤维化的作用［4］。

随着对肝纤维化机制了解的深入，细胞外基质-整合素-细胞骨架调控系统在肝纤维化中的作用越来越受到重视。整合素作为一类黏附分子，主要由α 和β 两条肽链以非共价键连接而形成的异二聚体的跨膜糖蛋白，其配体主要为细胞外基质(ECM)蛋白［10］。目前认为肝星状细胞的激活、凋亡等与细胞外基质、黏附分子的相互作用密切相关［11］。也有报道ECM-整合素-细胞骨架组成的黏着斑已成为肝纤维化进展的关键环节，ECM 可以与整合素通过FAK信号传导来调控肝星状细胞(HSC)的活化增殖与凋亡，进而影响肝纤维化的进程［3］。

基膜性MMPs 主要包括MMP-2 和MMP-9，是调控肝内细胞外基质(ECM)降解的主要酶类，其在肝纤维化中的作用，目前仍存在不同观点，有认为MMP-9 可以破坏肝窦内基底膜，破坏肝细胞内环境，致使肝星状细胞(HSC)活化，促进肝纤维化的形成［12］。也有研究表明增加MMP-9 表达量不仅可以降解过多沉积的间质性胶原纤维，而且抑制HSC 胶原酶表达及减少基质金属蛋白酶抑制因子的产生，对逆转肝纤维化发挥有利作用［13，14］。本实验结果发现模型组大鼠MMP-9 表达量明显增多，至于在肝纤维化进程中起促进或逆转作用，目前机制尚未明确:一方面肝纤维化形成中由于胶原过度沉积，MMP-9 持续升高可能是机体代偿性降解过度沉积的细胞外基质;另一方面MMP-9 持续增多，是否破坏内基底膜及促进HSC 激活，此方面的论据仍有待进一步考证。

Sheu 等研究表明MMP-9、Integrin-β1 存在多种生物体内，并且可以表达于多种正常细胞［15］。本实验中各组大鼠肝内均可见到MMP-9、Integrin-β1 表达，与Sheu 等研究结果一致。但肝硬化大鼠MMP-9、integrin-β1 表达较正常大鼠异常增多，说明MMP-9、Integrin-β1 与肝纤维化密切相关，其在基因和蛋白的高表达与肝硬化呈正相关，两者之间可能通过(细胞外基质-整合素-细胞骨架)的黏附而发挥协同作用。天然牛磺酸可以显著降低MMP-9、Integrinβ1mRNA 及蛋白表达，以中、高剂量组较明显，可见天然牛磺酸抗肝硬化的作用机制可能与调控MMP-9、Integrin-β1 表达水平有关，但天然牛磺酸对MMP-9、Integrin-β1 调控机制及信号传导途径仍未明了，有待进一步深入研究。

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