鳢肠不同部位抗骨质疏松活性及化学成分比较研究

黄运喜，易 骏，吴建国，郑淑霞，吴锦忠，吴岩斌*

1福建中医药大学中西医结合研究院，福州 350122;2 福建教育学院理科部，福州 350001

墨早莲原名鳢肠，《本草图经》称为旱莲草，又称为金陵草、旱莲子等［1］。2010 年版《中国药典》记载中药墨旱莲为鳢肠Eclipta prostrata L.的干燥地上部分，具有滋补肝肾，凉血止血的功效，用于肝肾阴虚，牙齿松动，须发早白，眩晕耳鸣，腰膝酸软，阴虚血热吐血、衄血、尿血、血痢、外伤出血［2］;1999 年出版的《中华本草》记载墨旱莲来源为鳢肠属植物鳢肠Eclipta prostrata(L.)L.［verbesina prostrata L.;E.Alba(L.)Hassk.］的全草［3］。现代化学和药理研究表明，墨旱莲主要黄酮类、噻吩类和香豆草醚类等化学成分，具有保肝、止血、抗炎、免疫调节、抗蛇毒、抗菌、抗氧化和抗骨质疏松等生物活性［4-8］。

前人研究墨旱莲所选用材料为鳢肠全草而非干燥地上部分(墨旱莲)［9，10］，且在市场流通中的墨旱莲药材，常混入鳢肠的根，而2010 年版《中国药典》记载为墨旱莲为鳢肠干燥地上部位。因为对鳢肠全草或地上部分(墨旱莲)入药存在争议，因此比较鳢肠不同部位的生物活性及化学成分是否有差异来评价鳢肠根可否与地上部分(墨旱莲)同时入药，对指导中医临床用药具有重要的意义。本实验以成骨细胞增殖和分化以及墨旱莲中主要化学成分皂苷和黄酮的含量为评价指标，研究鳢肠不同部位抗骨质疏松作用和化学成分的差异，为墨旱莲在中医临床用药及其资源利用提供依据。

1 材料和仪器

1.1 材料

鳢肠E.prostrata 采于福建省莆田市，由福建中医药大学药学院黄泽豪副教授鉴定。

大鼠骨肉瘤(UMR106)细胞由上海第二军医大学生药教研室赠送。DMEM 高糖培养液，胎牛血清，胰蛋白酶(美国Hyclone 公司)，青霉素-链霉素双抗试剂(北京鼎国昌盛生物技术有限公司);MTT干粉(美国Sigma 公司);其余所用药品和试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器和试剂

RE-2000 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);KQ-300DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);UV-1800 紫外可见分光光度计(日本岛津公司);DLSB-5/20 低温冷却循环泵(郑州长城科工贸有限公司);YXQ-LS-70A 立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);移液器(德国Eppendorf);Anke TDL-50B 离心机(上海安亭科学仪器厂);SW-CJ-1FDA 超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);BCD-518WS A 冰箱(海尔);5417R 高速冷冻离心机(德国Eppendorf);HF212UV CO2 培养箱(Heal Force);TS100 倒置生物显微镜(Nikon);ELX800 酶标仪(biotek);DK-420 型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司);AR233CN 电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)。

2 方法

2.1 不同部位提取物的制备

分别称取鳢肠根，茎，叶按料液比为1 ∶15 用80%乙醇回流提取2 次，每次2 h，合并滤液得提取液。

2.2 细胞培养

UMR106 细胞培养于含有10%新生胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM 高糖培养液中，置37 ℃含有5% CO2的细胞培养箱中培养。当细胞生长达到对数生长期时，用0.05%含EDTA 胰酶消化传代或接种。

2.3 UMR106 细胞的增殖实验

将UMR106 细胞用含10% 新生胎牛血清的DMEM 高糖培养液配制成密度为5 ×104/mL 的细胞悬液，以100 μL 每孔的体积接种于96 孔培养板中，培养24 h 后，根、茎、叶三个部位提取物分别以50、25、12.5 μg/mL 三个浓度给药，每个浓度5个复孔，继续放入培养箱培养48 h，取出培养板，各孔加入100 μL 四氮唑蓝(MTT，用PBS 液配制1 mg/mL的MTT 液)，放入培养箱中孵育4 h，取出培养板，在倒置相差显微镜下可见细胞内有条状黑色沉淀，弃去上清液，每孔加入DMSO(二甲基亚砜)100 μL，DMSO 的颜色变成紫色，把96 孔培养板放于酶标仪上震荡10 min 后使沉淀完全溶解于DMSO，于490 nm 处检测各孔A 值。

2.4 UMR106 细胞的ALP 活性实验

将UMR106 细胞用含10% 新生胎牛血清的DMEM 高糖培养液配成密度为5 ×104/mL 的细胞悬液。以100 μL 每孔的体积接种于96% 培养板中，培养24 h 后，根、茎、叶三个部位提取物分别以100、50、25 μg/mL 三个浓度给药，每个浓度5个复孔，继续放入培养箱培养，以后每3 天更换一次药。培养至第8 d 测定。弃去培养液，PBS 冲洗2～3次，加50 mmol/L 的二乙醇胺100 μL，2.5 mmol/L的对硝基苯酚磷酸二钠50 μL，37 ℃反应30 min，最后用0.3 mol/L 的氢氧化钠100 μL 终止反应，于405 nm 处测A 值［8］。

2.5 皂苷及黄酮含量测定

2.5.1 标准品溶液的制备

精密称取5.1 mg 旱莲苷A 标准品，加甲醇定容至50 mL，配成0.102 mg/mL 溶液，作为皂苷对照品溶液。

精密称木犀草素对照品20.1 mg，置于100 mL容量瓶中，加入60%乙醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，作为黄酮对照品溶液(即0.201 mg/mL)。

2.5.2 皂苷标准曲线绘制

精密吸取旱莲苷A 对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mL 分别置具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，加入新配制的1%香草醛-高氯酸溶液0.5 mL，60 ℃水浴中加热15 min，立即冰水冷却2 min，加77%硫酸溶液5.0 mL，摇匀，于550 nm 处测定吸光度。以含量(C)与吸光度(A)进行直线回归，得回归方程A=0.0336C +0.0007，R2=0.9994(图1)，线性关系良好。

图1 旱莲苷A 标准曲线Fig.1 The standard curve of ecliptasaponin A

2.5.3 黄酮标准曲线绘制

分别吸取标准应用液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 mL 于25 mL 容量瓶中，用60%乙醇定容至10 mL，先加5%的亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min;再加10%的硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min;再加4%的氢氧化钠溶液10 mL，用60%甲醇稀释至刻度，放置10 min，在波长512 nm 处测定吸光度［11］，以含量(C)与吸光度(A)进行直线回归，得回归方程A=0.0221C-0.007，R2=0.9992(图2)，线性关系良好。

图2 木犀草素标准标曲线Fig.2 The standard curve of luteolin

2.5.4 样品的皂苷及黄酮含量测定

精密吸取供试品溶液0.1 mL 置具塞试管中，水浴上挥去溶剂，按2.5.2 项下操作，相应试剂随行空白对照，于550 nm 处测定吸光度，计算皂苷的含量。

精密吸取供试品溶液1.0 mL 于25 mL 容量瓶中，按2.5.3 项下操作，在波长512 nm 处测定吸光度，计算黄酮含量。

2.6 统计学处理

采用SPSS 18.0 软件进行统计分析，组间采用单因素方差分析(ANOVA)，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 鳢肠不同部位对UMR106 细胞增殖的影响

鳢肠根、叶的80%乙醇提取物对UMR106 细胞均具有增殖作用，浓度为50 μg/mL 时作用最强，增殖率分别为7.7%(P＜0.01)，16.9%(P＜0.001)(图3)，其中叶的提取物增殖对UMR106 细胞的增殖能力最强，且P＜0.001 具有显著性差异。

图3 鳢肠不同部位提取物对UMR106 细胞增殖的影响Fig.3 Effect of the extracts from different parts of E.prostrata on UMR-106 cell proliferation.

3.2 鳢肠不同部位对UMR106 细胞ALP 活性的影响

鳢肠根、茎、叶的80%乙醇提取物对UMR106细胞的ALP 活性均具有促进作用，浓度为100 μg/mL 时作用最强，分别促进18.9%(P＜0.001)，20.1%(P＜0.01)，17.0%(P＜0.001)(图4)。

4 鳢肠不同部位提取物对UMR106 细胞ALP 活性的影响Fig.4 Effect of the extracts from different parts of E.prostrata on UMR-106 cell ALP activity

3.3 鳢肠不同部位总皂苷和总黄酮含量

鳢肠根，茎，叶中皂苷含量分别为3.6%，4.0%，2.2%;黄酮含量分别为1.4%，1.4%，3.4%(图5)。其中鳢肠茎中的皂苷含量最高，而黄酮含量最低;叶中的皂苷含量最低，而黄酮含量最高，根的皂苷、黄酮含量居中。

图5 鳢肠不同部位总皂苷和总黄酮含量Fig.5 The contents of total saponins and total flavonoids from different parts of E.Prostrata

4 讨论

成骨细胞在骨形成过程中主要经历成骨细胞增殖、细胞外基质成熟、矿化和成骨细胞凋亡四个阶段［12］。其中，成骨细胞增殖期成骨细胞数量增加，形成多层细胞，并合成、分泌I 型胶原以便最终可以矿化形成骨结节;在增殖晚期，成骨细胞增殖速度减慢，由增殖期进入分化期;在分化早期主要是ALP表达，ALP 是成骨细胞所分泌的一种同源二聚体糖蛋白，其表达的强度是识别和评价成骨细胞分化程度的早期特异性标志，而且表达随着细胞分化的发展而增强。因此，ALP 被认为是细胞外基质早期和中期分化的标志［13］。骨代谢中，骨生成与成骨细胞的增殖与ALP 活性相关［14］。

墨旱莲是滋补肝肾的常用中药，含有多种黄酮和皂苷类成分，其所含的黄酮类成分木犀草素、芹菜素、槲皮素、Dismetin、3'-hydroxybiochanin A 和3'-Omethylorobol 等［7，15，16］均具有一定的抗骨质疏松作用。研究结果显示鳢肠不同部位乙醇提取物对UMR106 成骨细胞增殖和ALP 活性有不同程度的促进作用，其中鳢肠根对成骨细胞增殖和ALP 活性均有显著的促进作用，对ALP 活性的促进作用与茎和叶的差异并不大。化学成分分析结果显示，鳢肠不同部位总皂苷和总黄酮的含量差异较大，其中根与茎的总皂苷和总黄酮含量差异并不大。

墨旱莲为鳢肠地上干燥部分，实验表明，鳢肠的根与鳢肠地上部分有相似的生物活性，这可能也是文献记载墨旱莲为醴肠全草入药的原因［3］。因此，我们认为，市场流通中的墨旱莲药材中混有少量的醴肠根并不会影响到墨旱莲药材的整体质量。另外，虽然已有许多墨旱莲皂苷和黄酮化学成分的研究［6，10，17］，但至今其质量标准中仍未有该项目的检测，因此建立墨旱莲总皂苷和总黄酮的测定方法为其药材质量标准的研究提供依据。

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