红花的化学成分及DPPH 自由基清除活性研究

Olaleye Olajide，李珊珊，刘海涛，柴 欣，王跃飞*，高秀梅

1天津中医药大学中医药研究院天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，天津 300193;2天津国际生物医药联合研究院中药新药研发中心，天津 300457

红花为菊科红花属植物红花(Carthamus tinctoriusL.)的干燥花，是活血通经、祛瘀止痛之良药。现代药理学研究表明，红花具有扩张血管、增加血流量、改善微循环和抑制血小板聚集等作用，其主要有效成分为黄酮类［1］。为了阐明红花的化学物质基础，寻找其活性成分，本课题较为系统地研究了红花的化学成分，并采用TLC-DPPH 生物自显影法对红花提取物各萃取部位及单体化合物开展DPPH 自由基清除活性研究，明确了其抗氧化活性的物质基础。

1 仪器与材料

Bruker AV Ⅲ核磁共振谱仪(瑞士Bruker 公司);A1204 万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);RE-52A 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);TH-Ⅱ型薄层加热器(上海科哲生化科技有限公司);ZF-20D 暗箱式紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂);Aglient 1260 制备液相(美国Agilent 公司);LINOMAT5 半自动点样仪(瑞士CAMAG 公司);薄层层析硅胶GF254、柱层析硅胶(青岛海洋化工厂);Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶(瑞士GE Healthcare 公司);D101 大孔吸附树脂(天津海光化工有限公司);聚酰胺(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂);DPPH 试剂(美国Sigma 公司);抗坏血酸(天津市北方天医化学试剂厂);所用试剂均为分析纯。

红花药材由步长制药集团提供，产地新疆，标本存于天津国际生物医药联合研究院化学与分析实验室。

2 提取与分离

红花的干燥花10 kg，用95%、50%乙醇各冷浸提取两次，减压回收乙醇至无醇味，合并浓缩液并加入适量水混悬，依次用石油醚(沸程60～90 ℃)、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得石油醚萃取物400 g、二氯甲烷萃取物67 g、乙酸乙酯萃取物114 g、水部分1200 g。水部分经D101 大孔树脂柱分离，不同浓度乙醇梯度洗脱，得30%乙醇洗脱部位450 g。乙酸乙酯萃取物经多次硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、聚酰胺柱色谱及制备液相分离，得到化合物1 (8.3 mg)、2 (22.2 mg)、3 (31.5 mg)、4 (12.1 mg)、5 (12.4 mg)、6 (10.5 mg)、9 (4.5 mg)、10(31.1 mg)、11 (25.6 mg)、12 (5.7 mg)、13 (6.5 mg)、14 (60 mg)。水部分30%乙醇洗脱部位经多次凝胶柱色谱及制备液相分离，得到化合物7 (5.5 mg)、8 (11.9 mg)。

3 结构鉴定

化合物1 淡黄色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液显黄色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:11.82(1H，s，4-OH)，11.66 (1H，s，H-1)，7.91 (1H，s，H-9)，7.70 (1H，s，H-6)，2.49 (3H，s，H-11)，2.47(3H，s，H-12);13C NMR (100 MHz，DMSO)δ:150.1(C-2)，160.7 (C-4)，125.9 (C-6)，141.7 (C-7)，138.4 (C-8)，128.8 (C-9)，20.3 (C-11)，19.7 (C-12)，144.7 (C-1a)，130.3 (C-4a)，146.5 (C-5a)，138.9 (C-9a)。其理化性质及波谱数据与文献［2］报道相符，故鉴定化合物1 为异光黄素(isolumichrome)。

化合物2 白色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液显黄色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:12.24(1H，s，5-OH)，9.58 (1H，s，4'-OH)，7.31 (2H，d，J=8.4Hz，H-2'，6')，6.79 (2H，d，J=8.4Hz，H-3'，5')，5.96 (1H，s，H-8)，5.43 (1H，dd，J=12.8，2.8 Hz，H-2)，4.63 (1H，d，J=7.6 Hz，H-1″)，3.28(1H，m，H-3ax)，2.68 (1H，dd，J=17.2，2.8Hz，H-3eq);13C NMR (100 MHz，DMSO)δ:79.0 (C-2)，42.5 (C-3)，197.5 (C-4)，102.3 (C-4a)，155.5 (C-5)，126.7 (C-6)，159.8 (C-7)，95.5 (C-8)，159.1(C-8a)，129.3 (C-1')，128.8 (C-2'，6')，115.6 (C-3'，5')，158.2 (C-4')，105.2 (C-1″)，74.3 (C-2″)，76.6 (C-3″)，70.0 (C-4″)，77.7 (C-5″)，61.2 (C-6″)。其理化性质及波谱数据与文献［3］报道相符，故鉴定化合物2 为(2S)-4'，5，6，7-四羟基二氢黄酮-6-O-β-D-葡萄 糖苷((2S)-4'，5，6，7-tetrahydroxyflavanone 6-O-β-D-glucopyranoside)。

化合物3 亮黄色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液显黄色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:7.30(2H，d，J=8.4Hz，H-2'，6')，6.79 (2H，d，J=8.4Hz，H-3'，5')，5.85 (1H，s，H-8)，5.38 (1H，dd，J=12.8，2.8 Hz，H-2)，4.56 (1H，d，J=8.0 Hz，H-1″)，3.21 (1H，m，H-3ax)，2.64 (1H，dd，J=16.8，3.0 Hz，H-3eq);13C NMR (100 MHz，DMSO)δ:78.8(C-2)，42.5 (C-3)，196.5 (C-4)，101.3 (C-4a)，159.2 (C-5)，129.5 (C-6)，158.1 (C-7)，96.0 (C-8)，155.3 (C-8a)，127.4 (C-1')，128.7 (C-2'，6')，115.6 (C-3'，5')，158.1 (C-4')，105.7 (C-1″)，74.4(C-2″)，76.8 (C-3″)，70.0 (C-4″)，77.7 (C-5″)，61.2 (C-6″)。其理化性质及波谱数据与文献［4］报道相符，故鉴定化合物3 为新红花苷 (neocarthamin)。

化合物4 黄色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液显黄色。1H NMR (400 MHz，CD3OD)δ:8.10(2H，d，J=8.6 Hz，H-2'，6')，6.92 (2H，d，J=8.6 Hz，H-3'，5')，6.41 (1H，s，H-8)，6.20 (1H，s，H-6);13C NMR (150 MHz，CD3OD)δ:146.6 (C-2)，135.7 (C-3)，176.0 (C-4)，156.9 (C-5)，97.9 (C-6)，164.2 (C-7)，93.1 (C-8)，161.1 (C-9)，103.2(C-10)，122.3 (C-1')，129.3 (C-2'，6')，114.9 (C-3'，5')，159.2 (C-4')。其理化性质及波谱数据与文献［5］报道相符，故鉴定化合物4为山柰酚(kaempferol)。

化合物5 亮黄色块状晶体(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液显黄色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:12.62 (1H，brs，5-OH)，10.25 (2H，brs，7，4'-OH)，8.04 (2H，d，J=8.8 Hz，H-2'，6')，6.88 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3'，5')，6.43 (1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.20 (1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.46 (1H，d，J=7.6 Hz，H-1″);13C NMR (100 MHz，DMSO)δ:156.9 (C-2)，133.6 (C-3)，177.9 (C-4)，161.7 (C-5)，99.2(C-6)，164.7 (C-7)，94.1 (C-8)，156.7 (C-9)，104.4 (C-10)，121.4 (C-1')，131.4 (C-2'，6')，115.6 (C-3'，5')，160.4 (C-4')，101.3 (C-1″)，74.7(C-2″)，76.9 (C-3″)，70.4 (C-4″)，78.0 (C-5″)，61.3 (C-6″)。其理化性质及波谱数据与文献［6］报道相符，故鉴定化合物5 为山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(kaempferol 3-O-β-D-glucoside)。

化合物6 亮黄色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液显黄色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:12.57(1H，s，5-OH)，10.86 (1H，brs，7-OH)，10.13 (1H，brs，4'-OH)，7.99 (2H，d，J=8.8 Hz，2'，6'-H)，6.88(2H，d，J=8.8 Hz，3'，5'-H)，6.41 (1H，d，J=2.0 Hz，8-H)，6.20 (1H，d，J=2.0 Hz，6-H)，5.31 (1H，d，J=7.2 Hz，H-1″)，4.38 (1H，brs，H-1''')，0.99(3H，d，J=6.4 Hz，H-6''');13C NMR (100 MHz，DMSO)δ:156.2 (C-2)，133.1 (C-3)，177.5 (C-4)，161.0 (C-5)，98.5 (C-6)，163.9 (C-7)，93.8 (C-8)，156.9 (C-9)，104.0 (C-10)，120.9 (C-1″)，130.7 (C-2″，6″)，115.1 (C-3″，5″)，160.0 (C-4″)，101.9 (C-1″)，74.2 (C-2″)，76.4 (C-3″)，69.9 (C-4″)，75.7 (C-5″)，66.9 (C-6″)，100.8 (C-1″')，70.3(C-2″')，70.6 (C-3″')，71.8 (C-4″')，68.3 (C-5″')，17.8 (C-6'″)。其理化性质及波谱数据与文献［6］报道相符，故鉴定化合物6 为山柰酚-3-O-β-芸香糖苷(kaempferol 3-O-β-rutinoside)。

化合物7 暗黄色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液显黄色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:12.24(1H，s，5-OH)，8.03 (2H，d，J=8.8 Hz，H-2'，6')，6.92 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3'，5')，6.53 (1H，s，H-8)。其理化性质及波谱数据与文献［7］报道相符，故鉴定化合物7 为6-羟基山柰酚(6-hydroxykaempferol)。

化合物8 暗黄色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液显黄色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:12.42(1H，s，5-OH)，10.51 (1H，brs，7-OH)，10.13 (1H，brs，4'-OH)，8.77 (1H，brs，6-OH)，8.03 (2H，d，J=8.8 Hz，H-2'，6')，6.88 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3'，5')，6.53 (1H，s，H-8)，5.46 (1H，d，J=7.6 Hz，H-1″);13C NMR (100 MHz，DMSO)δ:156.6 (C-2)，133.3 (C-3)，178.0 (C-4)，146.9 (C-5)，129.5 (C-6)，154.0 (C-7)，94.0 (C-8)，149.4 (C-9)，104.8(C-10)，121.6 (C-1')，131.3 (C-2'，6')，115.5 (C-3'，5')，160.3 (C-4')，101.5 (C-1″)，74.7 (C-2″)，76.9 (C-3″)，70.4 (C-4″)，77.9 (C-5″)，61.3 (C-6″)。其理化性质及波谱数据与文献［7］报道相符，故鉴定化合物8 为6-羟基山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(6-hydroxykaempferol 3-O-β-D-glucoside)。

化合物9 亮黄色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液显黄色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:12.49(1H，s，5-OH)，10.77 (1H，brs，7-OH)，9.58 (1H，brs，4'-OH)，9.35 (1H，brs，3'-OH)，9.30 (1H，brs，3-OH)，7.68 (1H，d，J=2.4 Hz，H-2')，7.54 (1H，dd，J=2.4，8.4 Hz，H-6')，6.88 (1H，d，J=8.8 Hz，H-5')，6.41 (1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.19 (1H，d，J=2.0 Hz，H-6)。其理化性质及波谱数据与文献［8］报道相符，故鉴定化合物9 为槲皮素(quercetin)。

化合物10 白色针状晶体(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液不显色。1H NMR (600 MHz，CD3OD)δ:7.90(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.84 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)。其理化性质及波谱数据与文献［9］报道相符，故鉴定化合物10 为对羟基苯甲酸 (phydroxybenzoic acid)。

化合物11 白色块状晶体(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液显紫色。1H NMR (400 MHz，CD3OD)δ:7.62(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，7.48 (2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6)，6.82 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3，5)，6.30(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)。其理化性质及波谱数据与文献［9］报道相符，故鉴定化合物11 为对羟基桂皮酸(p-hydroxycinnamic acid)。

化合物12 淡黄色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液不显色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:10.91(2H，brs，-NH)，7.39 (1H，d，J=7.6 Hz，H-6)，5.45(1H，d，J=7.6 Hz，H-5)。其理化性质及波谱数据与文献［2］报道相符，故鉴定化合物12 为尿嘧啶(uracil)。

化合物13 白色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液不显色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:12.77(1H，brs，9-NH)，8.11 (1H，s，H-2)，8.09 (1H，s，H-8)，7.07 (2H，brs，6-NH2)。其理化性质及波谱数据与文献［10］报道相符，故鉴定化合物13 为腺嘌呤(adenine)。

化合物14 白色针状晶体(氯仿)，5%硫酸乙醇溶液显紫红色。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ:5.37(1H，brd，J=5.2 Hz，H-6)，3.59～3.54 (1H，m，H-3)，1.03 (3H，s，H-19)，0.95 (3H，d，J=6.8 Hz，H-21)，0.87 (3H，t，J=7.6 Hz，H-29)，0.86 (3H，d，J=7.6 Hz，H-26)，0.84 (3H，d，J=7.2 Hz，H-27)，0.71 (3H，s，H-18)。其理化性质及波谱数据与文献［11］报道相符，故鉴定化合物14 为β-谷甾醇(βsitosterol)。

4 DPPH 自由基清除活性研究

4.1 样品的制备

分别称取适量抗坏血酸(Vc)、红花提取物的二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、水层样品、分离得到的14 个单体化合物，甲醇溶解，配制成浓度为2 mg/mL 的样品溶液，依次稀释5 倍，得到浓度为0.4 和0.08 mg/mL 的样品溶液。称取DPPH50 mg，用无水乙醇溶解于50 mL 棕色容量瓶中，得到0.1% (w/v)DPPH 无水乙醇溶液。

4.2 实验方法

将高(2 mg/mL)、中(0.4 mg/mL)、低(0.08 mg/mL)浓度样品溶液分别点样于薄层硅胶板，以Vc 为阳性对照，甲醇为空白对照，每个样品点样量3 μL。溶剂挥干后，将0.1%DPPH 无水乙醇溶液均匀喷于硅胶板上，30 min 后观察显色结果，共重复三次。

图1 DPPH 处理前后的点样薄层板Fig.1 TLC result before and after dealing with DPPH

4.3 实验结果与讨论

如图1 所示:红花乙醇提取物乙酸乙酯萃取物、二氯甲烷萃取物具有明显的DPPH 自由基清除活性，水层活性较弱。以Vc 为阳性对照，从乙酸乙酯萃取物中分离到的化合物4 (山柰酚)、9 (槲皮素)、11 (对羟基桂皮酸)具有明显的DPPH 自由基清除活性，化合物2 ((2S)-4'，5，6，7-四羟基二氢黄酮-6-O-β-D-葡萄糖苷)、3 (新红花苷)、5 (山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷)、6 (山柰酚-3-O-β-芸香糖苷)、10 (对羟基苯甲酸)及从水层分离得到的化合物7(6-羟基山柰酚)、8 (6-羟基山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷)具有一定的DPPH 自由基清除活性，而化合物1(异光黄素)、12 (尿嘧啶)、13 (腺嘌呤)、14 (β-谷甾醇)未显示DPPH 自由基清除活性。

1 Chang HT(常海涛)，Han HX(韩宏星)，Tu PF(屠鹏飞)，et al.Chemical constituents and pharmacological activities of traditional Chinese medicine Carthamus tinctorius L..World Notes Plant Med(国外医药·植物药分册)，1999，14:201-203.

2 Li LY(李莉娅)，Deng ZW(邓志威)，Li J(李军)，et al.Chemical constituents from Chinese marine sponge Cinachyrellaaus traliensis.JPeking Univ Health Sci(北京大学学报:医学版)，2004，36:12-17.

3 Zhao MB，Ito Y，Tu PF.Isolation of a novel flavanone 6-glucoside from the flowers of Carthamus tinctorium(Honghua)by high-speed counter-current chromatography.J Chromatogr A，2005，1090:193-196.

4 Jiang JS(姜建双).Studies on the chemical constituents and bioactivities of Carthamus tinctoriusL..Beijing:Peking Union Medical College(北京协和医学科学院)，PhD.2005.

5 Luo L(罗镭)，Zhang L(张琳)，Tian JK(田景奎)，et al.Chemical constituents from leaves of Lindera aggregate.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2009，40:856-858.

6 KazumaK，Takahashi T，Sato K，et al.Quinochalcones and flavonoids from fresh florets in diffident cultivars of Carthamus tinctorius L..Biosci Biotechnol Biochem，2000，64:1588-1599.

7 Hattori M，Huang XL，Che QM，et al.6-Hydroxykaempferol and its glycosides from Carthamus tinctorius petals.Phytochemistry，1992，31:4001-4004.

8 Chen L(陈龙)，Du LJ(杜力军)，Ding Y(丁怡)，et al.Studies on chemical constituents from flowers of Apocynum venetum.Chin J Chin Mater Med(中国中药杂志)，2005，30:1340-1342.

9 Zheng JX(郑俊霞)，Wang NL(王乃利)，Chen HF(陈海峰)，et al.Isolation and identification of phenolic constituents from Selaginella uncinata(Desv.)Spring.Chin J Med Chem(中国药物化学杂志)，2007，17:302-305.

10 Chen L(陈立)，Zhou YL(周义龙)，Xing RY(邢瑞云)，et al.Chemical constituents from metabolites of Deinococcus radiodurans.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2010，22:1001-1002.

11 Zhang X，Geoffroy P，Miesch M，et al.Gram-scale chromatographic purification of β-sitosterol:synthesis and characterization of β-sitosterol oxides.Steroids，2005，70:886-895.