白藜芦醇预处理对束缚应激大鼠胃溃疡的保护作用

张 红，问慧娟，周雅静，姜源涛

1河北大学附属医院;2 河北大学基础医学院，保定 071000

应激性胃溃疡是临床危重疾病的常见并发症，在重症监护室(ICU)的发生率可高达75%～100%，其发生机制尚未完全阐明，但越来越多的研究显示，氧化应激在应激胃黏膜损伤中发挥着重要作用，调节或干扰氧化应激以及氧化与抗氧化之间的平衡是胃肠道粘膜细胞保护的一个重要方面。白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种天然抗氧化剂，广泛存在于21 科31 属72 种植物中，其中葡萄、虎杖、花生、桑葚等常见植物中含量较高。近年来的研究表明，Res具有清除自由基、抗炎、抑制血小板聚集、舒张血管等多方面药理学作用，目前主要应用于心血管保护、衰老、肿瘤预防等方面。Res 对应激引起的急性胃粘膜损伤的作用尚未见报道，本实验以大鼠水浸-束缚应激(WRS)为模型，探讨Res 对应激性胃溃疡的保护作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

白藜芦醇(美国Amresco 公司)。NOS 试剂盒、NO 试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测试试剂盒(均由南京建成生物工程研究所提供)。Stat-Fax-2100 酶标仪(美国Awareness 公司);TDL-5-A 低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);XW-80A 型涡旋混匀器(上海沪西分析仪器厂);SHA-BA 型双功能水浴恒温振荡器(金坛市杰瑞尔电器有限公司)。

1.2 模型制作与分组

Wistar 大鼠(河北医科大学实验动物中心提供)30 只，雌雄各半，体重220～300 g，随机分为正常对照组(NG)、应激组(MG)、白藜芦醇低剂量组(LDG)、中剂量组(MDG)和高剂量组(HDG)。白藜芦醇各处理组以白藜芦醇分别按30、60、120 mg/kg灌胃3 d，NG 组和MG 组灌服同等容量的生理盐水。末次给药后，参照Cui 等人［1］的方法建立WRS 模型，8 h 后将动物用戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，剖腹，游离出胃。

1.3 胃酸测定

抽取胃液，pH 计测定胃液pH 值。

1.4 胃溃疡指数测定

结扎贲门、幽门端，用10 mL 生理盐水充灌，置于0.5%福尔马林溶液中固定5 min，沿胃大弯剪开，漂洗，用滤纸吸干水分，展平，观察溃疡形成情况，按改良Guth 标准［1］计算溃疡指数:病变的最大径＜1 mm 为1 分;1～2 mm 为2 分;2～3 mm 为3分;3～4 mm 为4 分;将＞4 mm 者分成若干段，每段按上法计分，若病灶宽于2 mm，其长度乘以2。全胃各病灶评分之和作为溃疡指数(Ulcer Index，UI)。

1.5 胃组织MDA、SOD 活性测定

留取溃疡明显处的胃粘膜组织约0.3 g，加9 倍的生理盐水，制备成10% 的组织匀浆，4 ℃3000 rpm 离心10 min，取上清液待测。各取50 μL 胃组织匀浆上清液，按试剂盒说明书进行操作。组织蛋白含量用考马斯亮兰法测定。

1.6 统计学分析

2 实验结果

2.1 形态学观察

正常大鼠胃黏膜表面光滑，未见水肿及出血点;WRS 各组大鼠胃腔内含大量咖啡样物质，冲洗后可见胃粘膜表面部分脱落，可见广泛分布、呈条索状或点状的深褐色溃疡面和出血点，溃疡周围呈弥漫性水肿，以应激组最为明显;Res 各组胃黏膜水肿、溃疡面及出血点均有不同程度减轻，以中剂量组作用显著。结果见图1。

图1 各组大鼠胃体部的形态学图片Fig.1 Gastric morphologic images of different groups

2.2 胃溃疡指数(UI)的变化

与对照组比较，应激组UI 显著升高(P ＜0.01);与应激组比较，Res 各组UI 显著降低(均P＜0.01)，以中剂量组作用显著，其中低、高剂量组与中剂量组比具均有显著差异(均P ＜0.01)，说明Res 可抑制胃溃疡产生，并具有一定的剂量依赖性;对照组UI 为0，见表1。

表1 白藜芦醇对WRS 模型胃溃疡指数、胃液pH、胃组织SOD、MDA 的影响(，n=6)Table 1 Effect of resveratrol on Ulceration Index，pH of gastric juice，SOD and MDA(，n=6)

表1 白藜芦醇对WRS 模型胃溃疡指数、胃液pH、胃组织SOD、MDA 的影响(，n=6)Table 1 Effect of resveratrol on Ulceration Index，pH of gastric juice，SOD and MDA(，n=6)

注:与对照组比较，＊＊P ＜0.01;与应激组比较，#P ＜0.05，## P ＜0.01;与中剂量组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。Note:Compare with control，＊＊P ＜0.01;Compare with model，#P ＜0.05，## P ＜0.01;Compare with middle dose Res group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01.

2.3 胃液pH 的变化

应激组大鼠胃液pH 明显低于对照组(P ＜0.01)，Res 各处理组均使pH 升高(P ＜0.05 或P ＜0.01)，但各剂量组之间没有显著差异，见表1。

2.4 胃粘膜组织SOD、MDA 活性的变化

应激组大鼠SOD 活性明显降低，MDA 含量明显升高，与对照组相比改变均有显著性差异(均P ＜0.01);Res 各组使这些指标均发生了相反变化(P ＜0.05 或P ＜0.01)，以中剂量组作用显著;其中低剂量组与中剂量组比有显著差异(P ＜0.05 或P ＜0.01)。见表1。

3 讨论

氧自由基通过脂质过氧化反应引起细胞膜、细胞器膜破坏，而且可与蛋白质巯基或色氨酸残基反应，导致蛋白质功能或酶活性丧失，引起细胞广泛的损伤。超氧阴离子()是生物体内最先形成、最主要的氧自由基，可被体内抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)及时清除。氧化和抗氧化平衡失调是许多疾病发生、发展的一种最基本、最普遍的危险因素。应激性胃溃疡的发病机制尚未完全阐明，目前普遍认为在应激性胃粘膜损伤中氧自由基是一个早期的、独立的致损伤因素而备受关注［2］。本实验结果也显示，应激刺激导致MDA 含量明显升高、SOD 活性显著降低。因此胃粘膜氧自由基产生和清除失衡是造成胃粘膜的损伤重要机制之一。

大量的研究发现许多中草药表现出了很好的抗溃疡作用，其突出机制是他们的抗氧化活性或清除活性氧簇(ROS)的能力。Res 是一种天然多酚类物质，具有很强的抗氧化性。Roghani 等发现1～100 μmol/L 的Res 能有效抑制细胞内外氧自由基的产生［3］;Leonard 等证实Res 是一个有效的羟基、超氧化物和金属诱导基团的清除剂，并对活性氧引起的细胞膜脂质过氧化和DNA 损伤具有保护作用［4］;Holthoff 也发现Res 是一种功能性过氧亚硝基阴离子清除剂［5］。本实验中，Res 预处理后明显减轻了WRS 大鼠胃黏膜的水肿、出血和溃疡面积，溃疡指数也显著降低，显示出Res 对应激性胃溃疡有明确的保护作用;Res 使胃粘膜组织SOD 的活性显著升高，MDA 含量降低，提示Res 通过减少氧自由基产生和增加其清除而抑制胃粘膜损伤，发挥了其抗氧化特性。实验中还发现Res 的抗溃疡作用以中剂量组显著，低剂量组也显示出改善胃溃疡的药效，但高剂量组作用反而减弱，可能与剂量过大而增加药物毒性作用有关，Dey 报道白藜芦醇在较高剂量加重溃疡［6］。

胃酸在应激性溃疡形成中的作用长期以来一直存在争议，现代普遍认为胃酸不是应激性溃疡发病的主要因素，但是胃酸的存在会加重胃粘膜损伤，促进溃疡发生。本研究显示束缚应激引起胃液pH 明显降低，Res 使胃液pH 升高，在一定程度上防止了胃溃疡的发生或加重。Res 提高胃液pH 的机制目前尚不清楚，贾一韬发现在束缚应激早期即有NFκB 信号通路的活化［7］，IL-lβ、IL-6 等细胞因子释放增加，强烈刺激下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)轴，使胃酸和胃蛋白酶分泌增多［8，9］，Res 可激活SIRT-1，抑制NF-κ 信号通路，下调TNF-α、IL-lβ、IL-6 表达，因而抑制胃酸分泌［10］。有研究发现NO 是胃酸分泌的内源性抑制剂［11］，Res 可提高eNOS 活性，增加NO 合成［12］，因而能抑制胃酸分泌，提高胃液pH。其具体机制有待进一步研究。

中药的药物作用通常被认为是更安全的传统疗法的替代，Res 通过其强抗氧化活性及抑制胃酸分泌而预防应激性胃粘膜的损伤。因此，Res 有望成为一种新型黏膜保护剂。

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3 Roghani M，Baluchnejadmojarad T.Mechanisms underlying vascular effect of chronic resveratrol in streptozotocin-diabetic rats.Phytother Res，2010，24(Suppl 2):148-154.

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6 Dey A，Guha P，Chattopadhyay S，et al.Biphasic activity of resveratrol on indomethacin-induced gastric ulcers.Biochem Biophys Res Commun，2009，381:90-95.

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