中国南海隋氏蒂壳海绵Theonellaswinhoei 的化学成分研究

甘建红，席 达，于豪冰，闵 倩，芶 了，谢 晶*

1上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306;2 第二军医大学附属长征医院海洋药物研究室，上海 200433;3 第二军医大学附属东方肝胆医院 微创外科2 室，上海 200438

海绵属动物界多孔动物门(Porifera)，是最原始的低等多细胞动物，可分为钙质海绵纲(Calcarea)、六放海绵纲(Hexactinellida)和寻常海绵纲(Demospongiae)三个纲。Theonella 属海绵属寻常纲(Demospongiae)、石海绵目(Lithistida)、蒂壳海绵科(Theonellidae)海绵。目前，已从该属海绵中获得了环肽、大环内酯、甾体、聚酮、生物碱、糖脂等成分。其中的甾体类化台物多为独特的4-亚甲基结构［1，2］;从中分离得到的环肽类化合物富含非常见氨基酸残基，具有良好的抗肿瘤活性［3，4］。我们对采自西沙永兴岛和七连屿附近的隋氏蒂壳海绵T.swinhoei 的化学成分进行了研究，从其正丁醇萃取部位首次分离鉴定了6 个化合物(1～6)(图1)，包括5 个嘧啶类化合物以及1 个咯嗪类化合物。

1 实验部分

1.1 样品

隋氏蒂壳海绵(Theonellaswinhoei Gray，1868)样品于2007 年5～6 月采自中国南海西沙永兴岛(Woody Island)和七连屿(Seven connected islets)。种属名称由青岛海洋研究所李锦和研究员鉴定。标本(No.DS-TS01)存放于第二军医大学长征医院海洋药物实验室。

1.2 仪器与试剂

图1 化合物1～6 的结构Fig.1 Structures of compounds 1-6

MS 谱用Q-Tof micro YA019 型液质联用仪测定;NMR 由Bruker AV-600 型核磁共振仪测定;HPLC 在Agilent 1200 高效液相色谱仪上完成;Sephadex-LH20 为Pharmacia 公司产品;层析硅胶(200～300、300～400 目)为烟台江友硅胶开发有限公司产品;常用有机溶剂均为国产分析纯。

1.3 提取与分离

将冷冻的隋氏蒂壳海绵(T.swinhoei，干重1.2 kg)切碎成小块，用95%乙醇(8 ×15 L)室温渗滤，合并提取液，减压浓缩得到总浸膏。将总浸膏混悬分散于水中，用乙酸乙酯萃取4 次，浓缩萃取液得到脂溶性浸膏。将脂溶性浸膏混悬于90%的甲醇水溶液中，用石油醚萃取3 次，浓缩萃取液得到石油醚部位浸膏56 g;加水将混悬液的甲醇浓度调整至60%，用二氯甲烷萃取3 次，浓缩萃取液得二氯甲烷部位浸膏5 g;余下的60%甲醇部分浓缩至干得浸膏1 g。将最初的水相用正丁醇萃取3 次，浓缩得正丁醇部位浸膏36 g。将正丁醇部位浸膏36 g 进行减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇(50∶1，20∶1，15∶1，10∶1，5∶1，2∶1)梯度洗脱成50 个流份，根据HPTLC 显色合并相似流份得到8 个组分。对第五组分进行反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱以及高效液相制备得到化合物1～6。

2 结果与讨论

2.1 结构鉴定

从海绵正丁醇萃取部位分离鉴定了6 个化合物(1～6)(图1)，包括5 个嘧啶类化合物以及1 个咯嗪类化合物。

化合物1 白色粉末，易溶于甲醇;mp.184～185 ℃;［α］+30.6°(c 1.029，H2O);。ESI-MS 显示有［M+Na］+峰m/z 265.15 及［2M +Na］+峰m/z 507.22，确定其分子量为242;IR(KBr)νmax3312，1700，1659 cm–1;结合13C NMR 谱，确定其分子式为C10H14N2O5。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6):δ 11.24(1H，brs，NH-3)，7.68(1H，d，J=1.2 Hz，H-6)，6.16(1H，dd，J=7.6，6.2 Hz，HO-5')，5.21(1H，brd，J=3.2 Hz，HO-3')，5.00(1H，t，J=5.6 Hz，H-1')，4.23(1H，m，H-3')，3.76(1H，m，H-4')，3.56(2H，m，H-5')，2.07(2H，m，H-2')，1.77(3H，d，J=1.1 Hz，CH3)。13C NMR (150 MHz，DMSO-d6):δ163.7(C-4)，150.5(C-2)，136.1(C-6)，109.4(C-5)，87.3(C-l')，83.8(C-4')，70.4(C-3')，61.3(C-5')，39.3(C-2')，12.2(5-CH3)。以上数据与文献［6］报道一致，鉴定化合物1 为thymidine。

化合物2 白色粉末，mp.244～246 ℃，易溶于甲醇。ESI-MS 显示有［M +Na］+峰m/z 293.10 及［2M+Na］+峰m/z 563.20，确定其分子量为312;结合13C NMR 谱，确定其分子式为C11Hl4N2O6。1H NMR(600 MHz，C5D5N):δ13.19(1H，brs，NH-3)，8.33(1H，brs，H-6)，7.18(ov，H-1')，4.95(m，H-3')，4.94(brs，H-4')，2.63(1H，dd，J=13.4，5.4 Hz，Ha-2')，2.28(1H，m，Hb-2')，2.01(3H，brs，HCH3)，3.68(3H，d，J=1.2 Hz，H-1″)。13C NMR(150 MHz，C5D5N):δ172.3(C-5')，164.6(C-4)，151.7(C-2)，136.2(C-6)，110.7(C-5)，86.7(C-l')，85.6(C-4')，74.7(C-3')，52.0(C-1″)，39.3(C-2')，12.7(5-CH3)。以上数据与文献［7］报道一致，鉴定化合物2 为thymidine-5'-carboxylic acidmethylester。

化合物3 白色粉末，易溶于甲醇，mp.208～214 ℃。ESI-MS 显示有［M+Na］+峰m/z 355.14及［2M+Na］+峰m/z 647.26，确定其分子量为312;结合13C NMR 谱，确定其分子式为C14H20N2O6。1H NMR(600 MHz，C5D5N):δ13.20(1H，brs，NH-3)，8.38(1H，brs，H-6)，7.20(dd，J=13.4，5.4 Hz，Hl')，4.98(m，H-3')，4.97(brs，H-4')，4.17(2H，t，J=6.6 Hz，H-1″)，2.66(1H，dd，J=9.2，5.4 Hz，Ha-2')，2.31(1H，m，Hb-2')，2.03(3H，brs，H-CH3)，1.49(2H，m，H-2″)，1.21(2H，m，H-3″)，0.76(3H，t，J=7.4 Hz，H-14″)。13C NMR(150 MHz，C5D5N):δ172.0(C-5')，164.6(C-4)，151.7(C-2)，136.2(C-6)，110.7(C-5)，86.8(C-1')，85.9(C-4')，74.8(C-3')，65.2(C-l″)，39.3(C-2')，30.5(C-2″)，19.0(C-3″)，13.4(C-4″)，12.7(5-CH3)。以上数据与文献［6］比对，鉴定化合物3 为thymidine-5’-carboxylic acid butyl ester。

化合物4 淡黄色针晶，EI/MS 显示有［M］+峰m/z112;结合13C NMR 谱，确定其分子式为C4H4N2O2。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6):δ10.98(1H，brs)，10.80(1H，brs)，7.36(1H，dd，J=7.6，5.7 Hz)，5.46(1H，dd，J=7.6，1.2 Hz)。13C NMR(150 MHz，DMSO-d6):δ164.6(C-4)，151.6(C-2)，142.5(C-6)，100.4(C-5)。以上数据与文献［8，9］报道一致，鉴定化合物4 为uracil。

化合物5 白色针状结晶，EI/MS 显示有［M］+峰m/z 126;结合13C NMR 谱，确定其分子式为C5H6N2O2。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6):δ10.87(1H，s)，10.46(1H，s)，7.26(1H，s)，1.72(3H，s)。13C NMR(150 MHz，DMSO-d6):δ166.8(C-4)，153.4(C-2)，109.1(C-5)，138.7(C-6)，13.1(5-CH3)。以上数据与文献［8，10］报道一致，鉴定化合物5 为thymine。

化合物6 淡黄色粉末，mp.279～281 ℃。ESIMS 显示有［M+H］+峰m/z 243;［M+H］+，265［M+Na］+and 507［2M+Na］+;结合13C NMR 谱，确定其分子式为C12H10N4O2。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6):δ11.85(1H，brs，1-NH)，11.77(1H，brs，3-NH)，7.85(1H，s，H-6)，7.68(1H，s，H-9)，2.46(3H，s，8-CH3)，2.43(3H，s，7-CH3);13C NMR(125 MHz，DMSO-d6):δ161.1(C-4)，150.3(C-2)，146.5(C-4a)，145.4(C-10a)，141.4(C-5a)，139.3(C-8)，138.3(C-7)，130.2(C-6)，129.1(C-9a)，125.8(C-9)，20.7(8-CH3)，20.1(7-CH3)。以上数据与文献［11，12］报道一致，鉴定化合物6 为7，8-Dimethyl-isoalloxazine。

2.2 讨论

在日本海域和我国台湾省都分布有隋氏蒂壳海绵T.swinhoei。从台湾南部垦丁的该种海绵中已发现含有环肽theonellapeptolidesIa，Id，IId 以及大环内酯swinholideA 等成分［13］。本文尚未从西沙此种海绵中分离到相同的成分，主要获得了5 个嘧啶类化合物和1 个咯嗪类化合物，进一步表明了西沙隋氏蒂壳海绵Tswinhoei 的活性化学成分多样性。本文的研究结果丰富了我国南海海洋天然产物结构，为进一步研究和开发我国南海海洋生物资源提供了参考资料。

1 SugoY，InouyeY，NakayamaN.Structures of nine oxygenated 4-methylene sterols from Hachijome sponge Theonellaswinhoei.Steroids，1995，60:738-742.

2 KhoE，magawaDK，Rohmer M，et al.Sterols in marine invertebrates.22.Isolation and structure elucidation of conicasterol and theonellasterol，two new 4-methylene sterols from the Red Sea sponges Theonellaconica and Theonellaswinhoei.J Organ Chem，1981，46:1836-1839.

3 Aneiros A，GarateixA.Bioactive peptides from marine sources:pharmacological properties and isolation procedures.J Chromatography，2004，803:41-53.

4 FusetaniN，MatsunagaS.Bioactive sponge peptides.Chemical Reviews，1993，93:1793-1806.

5 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assaya.J Immunol Methods，1983，65(1-2):55.

6 MortdcawaT，XieH，Matsuda H，et al.BioactiveConstituentsfrom Chinese Natural Medicines.XVII.Constituents with Radical Scavenging Effect and NewGlucosyloxybenzyl 2-Isobutylmalates from Gymnadeniaconopsea.Chemical ＆ Pharmaceutical Bulletin 2006，54:506-513.

7 DematteN，GuerrieroA，LafargueF，et al.2'-deoxynucleoside uronic acids from the aseidianAplidium(=Amaroucium)fuscum(Drasche，1=883).Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochem Mol Biol，1986，84(1):11-13.

8 GoldstcinJ H，TarpleyA R.Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectra of uracil，thymine，and the 5-halouracils.J Amer Chem Soci，1971，93:3573-3578.

9 Li WL(李文林)，Mao SL(毛士龙)，Yi YH(易杨华)，et al.Studies on the chemical constituents of the sponge phakelliafuscathiele.Chia J Mar Drugs(中国海洋药物)，2001，20:9-11.

10 Meng QH(孟艳辉)，Su JY(苏镜娱)，Zeng LM(曾陇梅).Studies on the chemical constituents from the South China Sea soft coral sarcophtonmolle.Chia J Mar Drugs(中国海洋药物)，1999，18(3):1-3.

11 Zhang QH(张起辉)，Zhou LD(周莲娣)，Lu X(卢轩)，et al.Chemical constituents from the marine NigrosporaSphaerica.J Shengyang Pharm Univ(沈阳药科大学学报)，2010，27:615-622.

12 Wang FW，Hou ZM，Wang CR，et al.Bioactivemetabolites from Penicillium sp.，an endophyticfungusresiding in Hopeahainanensis.J Microbio Bio Tech，2008，24:2143-2147.

13 Chen QY(陈清雨).Studies on bioactive constituents from Taiwan sponges.National Sun Yat-senUniversity，PhD.2001.