结合换算因子的苯酚-硫酸法测定红茶菌培养液中水溶性多糖含量的研究

范海涛 ，张虎成，曲 伟，王孟君，，刘欣欣，王鹏飞

1北京电子科技职业学院生物工程学院，北京 100029;2 北京联合大学，北京 100012;3军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100027

红茶菌(Kombucha)又名海宝或胃宝，在我国民间很早就有培养和流传，并作为一种日常饮用的传统饮料。近年来，国内外医学界的研究表明，红茶菌对多种慢性疾病，如高血压、冠心病、糖尿病等具有一定的疗效［1］，由于红茶菌的培养属于共生菌的混合发酵过程，故培养液成分复杂，目前认为多种成分决定了红茶菌培养液的活性。文献报道［2，3］，红茶菌培养液中含有较多的多糖类物质，并可能与香菇、灵芝和茯苓等真菌多糖类似，具有药物活性。本课题组前期初步活性研究表明，红茶菌多糖(Kombucha Polysaccharides，KPS)具有清除自由基的活性，与其他许多多糖活性相仿。

对红茶菌多糖含量的测定已有相关报道，如:程江峰［4］以苯酚-硫酸法对红茶菌多糖进行了含量测定，初步确定了测定条件。但是不同单糖与苯酚-硫酸试剂显色情况不同，其标准曲线的斜率也不同，甚至有些糖差别很大［5］，因此单纯用葡萄糖作标准曲线来计算多糖含量必然会存在较大误差。为了开发利用红茶菌多糖，需建立一种比经典方法更可行和准确的多糖部位中糖含量的测定方法。对于杂多糖，分析结果必须根据各单糖的组成比及各单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算，才能获得准确的结果，操作比较繁琐［6］。针对这个问题，有学者采用测定换算因子的方法来消除单纯以葡萄糖作标准曲线引起的误差［7，8］，并用于植物来源多糖的含量测定。

红茶菌培养液中多糖包括茶叶来源的植物多糖及发酵菌产生的细菌多糖和真菌多糖，其单糖组成及连接方式等相对较复杂，对苯酚-硫酸比色法进行含量测定的影响因素较多。本研究以精制红茶菌多糖测得红茶菌多糖对葡萄糖的换算因子，再以此校正采用苯酚-硫酸比色法测定的红茶菌粗多糖部位的多糖含量，并进行方法学考察，确定测定红茶菌多糖含量的快速、简便、可靠的方法。

1 仪器与试药

UV-5800 紫外/可见分光光度计，上海元析仪器有限公司;恒温培养箱，上海福玛实验设备有限公司;CARY50 全波长紫外扫描仪，瓦里安公司;旋转蒸发仪，德国Heidolph;电子天平，奥豪斯公司;高速离心机，上海安亭科学仪器厂;冷冻干燥机，天津因赛科技发展有限公司。

祁红茶叶，购于北京物美大卖场北苑店(产地福建省福安市福东茶厂);红茶菌菌种为本实验室保存;苯酚，为重蒸苯酚，购自北京鼎国生物技术有限责任公司;过氧化氢、葡萄糖、氯化钠、三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇等试剂均为分析纯;浓硫酸为优级纯。

2 方法与结果

2.1 红茶菌的培养

称取4 g 红茶，以1000 mL 的沸水煮20 min，加入50 g 葡萄糖，煮10 min，放凉后滤去茶叶补足水至1000 mL 作为红茶菌培养基。将培养基分装、灭菌、接种、培养后得到红茶菌培养液。

2.2 红茶菌多糖的提取与精制

培养10 d 后的红茶菌培养液，弃去菌膜，取菌液460 mL 沸水提取30 min，冷却后3000 rpm 离心，取上清，50 ℃减压浓缩至小体积，冷却至室温后加入乙醇，至溶液中乙醇的体积分数为80%，置于4℃冰箱中过夜，次日弃上清，并将沉淀挥干乙醇后以水溶解后再次离心，上清液再次以80%乙醇沉淀，4℃冰箱中过夜后弃上清，如此反复处理多次，直至目测多糖溶液无色，将多糖溶液以Sevag 法除蛋白多次，直至其在280 nm 处无明显紫外吸收峰，除蛋白结束，浓缩水层得粗多糖溶液，冷冻干燥得红茶菌粗多糖，为灰白色粉末51.8 mg，计算其得率为11.26 mg/100 mL。

将红茶菌粗多糖先后用过氧化氢、透析处理，并以无水乙醇、丙酮反复洗涤8 次后真空冷冻干燥，即得红茶菌精制多糖。本实验室曾对该操作下的黑骨藤精制多糖进行了验证，可保证多糖中基本不含其他杂质［9］。

2.3 标准曲线的绘制

2.3.1 苯酚溶液的配制

称取苯酚36 g，加入蒸馏水24 mL，即为60%的苯酚溶液，冰箱中密封避光长期保存。

取密封避光保存的60%苯酚溶液，放置于室温，精密移取5 mL 置于50 mL 的容量瓶中，定容，即为6%的苯酚溶液，临用前现配。

2.3.2 葡萄糖标准系列溶液的配制

精密称定105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖50 mg，蒸馏水定容于50 mL 容量瓶中，摇匀，配制成浓度为1 g/L 的储备液。从储备液中分别精密移取0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0 mL 置于9个50 mL 容量瓶中，蒸馏水定容，配制成10、20、40、50、60、70、80、100、120 mg/L 的葡萄糖标准系列溶液。

2.3.3 葡萄糖标准曲线的绘制

精密移取葡萄糖标准系列溶液各1.0 mL，空白取1.0 mL 水，分别置于50 mL 容量瓶中，各加6%的苯酚1.0 mL 后充分振摇，再迅速加入浓硫酸5.0 mL，振摇，室温放置40 min 后于490 nm 处测定吸光度，以葡萄糖浓度(C)对吸光度(A)进行线性回归，在10～100 mg/L 范围内得回归方程C=131.58A -4.88，r=0.9997，葡萄糖对照品在此范围内线性关系良好。

2.3.4 红茶菌精制多糖标准系列溶液的配制

按照2.3.2 方法，将红茶菌精制多糖配制成40、50、60、70、80 和100 mg/L 的标准系列溶液。

2.3.5 红茶菌精制多糖标准曲线的绘制

按照2.3.3 方法，得红茶菌精制多糖的回归方程C=797.22A-6.26，r=0.9991，红茶菌精制多糖在20～100 mg/L 范围内的线性关系良好。

2.4 换算因子的计算

根据苯酚-硫酸法测定糖含量的原理，不同种类的糖与苯酚-硫酸试剂显色情况不同，利用换算因子校正测定结果能够较好地消除这个因素带来的误差，使结果更准确。

精密称定红茶菌精制多糖20.3 mg，蒸馏水定容于50 mL 容量瓶中，配制成浓度为406 mg/L 的储备液。从中取出5 mL 置于25 mL 的容量瓶中，蒸馏水定容，配制成81.2 mg/L 的待测溶液。精密移取精制多糖的待测溶液1.0 mL，按照测定标准曲线的方法测定其吸光度，根据标准曲线计算其中的多糖浓度，按f=W/(C ×D)计算换算因子，其中W 为样品配制浓度(mg/L)，C 为通过葡萄糖标准曲线计算出的多糖浓度(mg/L)，D 为样品溶液稀释的倍数，本实验未进行稀释，D=1，测得f=5.93(n=3)。

2.5 粗多糖溶液的配制

精密称定红茶菌粗多糖77.7 mg，定容于10 mL容量瓶中，从中精密移取2 mL，定容于50 mL 容量瓶中，配制成浓度为310.8 mg/L 的储备液。从中取出10 mL 置于50 mL 的容量瓶中，定容，配制成62.2 mg/L 的待测溶液。

2.6 精密度试验

精密移取红茶菌粗多糖待测液1.0 mL，按测定标准曲线的方法测定其吸光度，平行测定6 份，得吸光度平均值为0.103，RSD 为4.2%(n=6)，表明此方法精密度良好。

2.7 显色稳定性试验

精密移取红茶菌粗多糖待测液1.0 mL，按测定标准曲线的方法分别于0、1、2、3、4 h 测定其吸光度，得吸光度平均值为0.108，RSD 为4.9%(n=5)。

2.8 加样回收率实验

精密吸取已知含量的红茶菌粗多糖待测溶液1.0 mL 6 份，分别置于6 个25 mL 容量瓶中，分别加入葡萄糖标准系列溶液1.0 mL，按测定标准曲线的方法操作，按下式计算加样回收率:R=［(M-P/f)/A］×100%，式中P 为加入的红茶菌粗糖浓度62.1 mg/L;A 为葡萄糖加入量;M 为(A+P)药量混合后进行回收实验所得测定值经换算后得到的总糖量;f 为红茶菌多糖-葡萄糖的换算因子5.93。测得平均加样回收率为101.40%，RSD 5.03%，见表1。

表1 红茶菌多糖加样回收率实验结果Table 1 Results of recovery test of Kombucha polysaccharides

2.9 红茶菌粗多糖含量测定

精密移取粗多糖待测溶液1.0 mL，按照测定标准曲线的方法测定其吸光度，根据葡萄糖标准曲线计算其中的多糖浓度。多糖含量=CDf/W ×100%，计算得红茶菌粗多糖部位中多糖的质量分数为86.93%，相对标准偏差(RSD)为4.2%(n=6)。按照实验2.2 中粗多糖收率，得红茶菌培养液中多糖含量为9.79 mg/100 mL。根据以上实验结果，确定苯酚-硫酸法结合换算因子测定红茶菌培养液中多糖方法可行。

3 讨论

苯酚-硫酸法测定糖含量时，糖的种类对结果影响较大，且个别糖之间有较大差别，简单以葡萄糖标准曲线对不同来源的多糖进行含量测定会使结果差异很大［10］，因此有必要采用换算因子法对测定结果进行校正，使测定结果更加接近真实值。本研究首次通过实验计算发现红茶菌多糖-葡萄糖的换算因子为5.93。

本实验室对红茶菌精制多糖进行了进一步分离，初步得到十一个多糖部位，对这些部位进行换算因子的测定，也有差异，表明这些多糖部位的单糖组成的不同，反映了换算因子校正测定结果只能尽可能接近真实值，应该针对具体的研究对象分别进行测定和计算，以保证实验结果的可靠性。

近年来，对细菌及真菌来源的多糖逐渐清晰的药理学研究，表明了其具有广阔的开发应用前景，红茶菌多糖部位中多糖含量测定结果的准确性，对红茶菌多糖的进一步研究、开发和利用有现实意义，本文采用的方法操作简便、显色稳定、重现性好、结果准确度高，可作为红茶菌多糖的含量测定方法。

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