高碱性提取的大豆油体的成分变化研究

曹艳芸 陈业明 华欲飞

高碱性提取的大豆油体的成分变化研究

曹艳芸 陈业明 华欲飞

（食品科学与技术国家重点实验室江南大学食品学院，无锡 214122）

以大豆油体（OB）为研究对象，详细地考察了高碱性提取条件对大豆油体成分的影响，主要包括油体主要成分（中性脂、蛋白质和磷脂）的含量、油体表面的蛋白质种类和氨基酸组成、中性脂脂肪酸组成和生育酚组成。结果表明，高碱性提取会使大豆油体表面的蛋白质和磷脂部分脱离油体，蛋白质／中性脂比值由0.097（pH 6.8 OB）减小为0.058（pH 11 OB），磷脂／中性脂比值由 0.068（pH 6.8 OB）减小为 0.029（pH 11 OB）；对中性脂部分（生育酚、脂肪酸）基本无影响；高碱性提取影响油体粒径和zeta电位，粒径由（509±3）nm（pH 6.8 OB）减小为（451±7）nm（pH 11 OB），等电点由介于4.5～5（pH 6.8 OB）提高为5.5～6（pH 11 OB）；同时说明，油体特殊的天然乳化结构对于保护植物种子中的中性脂意义重大。

大豆油体 高碱性提取 蛋白质 磷脂 中性脂 氨基酸分析 脂肪酸 生育酚

油体（oil body，简写OB）是含油植物种子贮藏三酰甘油的亚细胞微粒，粒径一般为0.5～2.5μm［1］。其主要成分有3种，为：中性脂（主要为三酰甘油，简写TAG）、油体蛋白和磷脂（PL）。油体内部为疏水的液态TAG核心，外层是由磷脂单分子层及镶嵌蛋白质形成的半单位膜，油体表面具有亲水性［2］。蛋白和磷脂通过提供空间位阻和静电排斥作用赋予油体高度的稳定性，同时能够防止某些非特异性脂肪酶与油体结合［3］。作为一种天然的纳米级大小的微胶囊［4］，大豆油体集中了大豆的多不饱和脂肪酸，同时含有磷脂和生育酚［5］。一方面，油体拥有稳定的天然乳化结构，并且含有许多营养成分；另一方面，国内大豆油体原料来源非常丰富。因此，大豆油体具有运用于食品和化妆品行业的巨大潜力［6］。

目前，油体的提取一般都采用碱性条件提取［7-8］。从植物种子提取油体的过程中，种子中的一些蛋白质会与油体发生结合，而碱性条件能破坏杂蛋白质与油体的相互作用。通常，大豆油体表面会结合有大豆 7S、11S球蛋白［7］以及 Gly m Bd 30K、P34等［9］过敏性蛋白，尤其是油体表面结合的过敏性蛋白会极大地限制油体在食品和化妆品行业的应用。Chen等［7］通过研究证明，pH 11碱性提取可以得到不含过敏性蛋白等杂蛋白的纯净油体。但是，高碱性提取条件是否会对油体的成分产生影响，目前未见详细报道。本试验以大豆油体为研究对象，中性提取的油体为参照，考察了强pH值提取条件对大豆油体的3种主要成分（中性脂、蛋白质和磷脂）的含量、蛋白质种类、蛋白质的氨基酸组成、中性脂的脂肪酸组成以及生育酚等的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：高油豆88-31（2012产）：南京农业大学研究所，贮存于4℃冰箱中备用。

仪器：Hitachi CR21G高速冷冻离心机：日本日立有限公司；Agilent 1100高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；Shimadzu GC-2010 Plus气相色谱仪：日本岛津有限公司；纳米粒度仪、zeta电位仪：英文马尔文仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆油体的提取

大豆在4℃浸泡18 h后，与水按质量比为1∶9混合，打浆，匀浆经4层纱布过滤，得到生豆浆，分为2份。加入适量蔗糖（最终质量浓度为20%），搅拌均匀。其中1份生豆浆不调节pH值（测得此时生豆浆pH值为6.8），另1份调pH值11后，离心（4℃，19 000 r／min，40 min）。离心后分为 3层，上浮即为油体。收集油体，将其重新分散于水中。加入20%蔗糖，溶解。再次调节至相应的pH值后离心。如此重复洗涤油体2次。最后得到的2种油体（pH 6.8 OB，pH 11 OB）分别分散于50 mL去离子水中，透析，冷冻干燥。

1.2.2 高碱性提取对大豆油体质组成的影响

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对蛋白质组成进行分析。其中，浓缩胶和分离胶浓度分别为5%和12.5%，用考马斯亮蓝G-250染色［10］。

1.2.3 高碱性提取对大豆油体主要成分含量的影响

1.2.3.1 中性脂含量计算

经冷冻干燥的2种油体，按1∶10加入冰丙酮提取中性脂肪，充分震荡，离心（4 000 r／min，20 min），移取上层有机相于已经恒重的平底烧瓶中。沉淀用冰丙酮重复提取5次。丙酮相于45℃真空浓缩后，于60℃真空干燥恒重。称重，计算中性脂肪含量。

1.2.3.2 蛋白质及磷脂含量计算

分别精确称量经冷冻干燥的油体样品（pH 6.8 OB，pH 11 OB）于已恒重的平底烧瓶（m1）中，加入1～1.5 mL离子水，按1∶50的固液比例加入氯仿-甲醇溶液（2∶1），60℃水浴回流提取全脂质，每次提取8 h，共更换3次提取液。将提取液合并后用已恒重的G3砂芯漏斗（质量m2）过滤。滤液经真空旋转蒸发除去有机溶剂，60℃真空干燥2 h。计算全脂质含量；用于提取脂质的圆底烧瓶以及砂芯漏斗置于105℃烘干恒重，质量分别记为：圆底烧瓶（m01），砂芯漏斗（m02）。4种油体中蛋白质含量以及磷脂按以下公式计算：

式中：mOB指相应油体的质量

磷脂含量＝全脂质含量-中性脂含量

1.2.4 高碱性提取对大豆油体的粒径及zeta电位的影响

新鲜制备的大豆油体（pH 6.8 OB，pH 11 OB）分散于去离子水中，缓慢搅拌3～4 h，使油体充分分散，形成均匀的乳状液。测定其粒径分布。

经透析的大豆油体（pH 6.8 OB，pH 11 OB）充分分散于水中，使其质量浓度约为0.05 mg／mL。将每种油体的分散液分成4份，分别调节pH值为4.5、5.0、5.5和6.0。测定zeta电位值。

1.2.5 高碱性提取对大豆油体氨基酸组成分析

经冷冻干燥的油体样品（pH 6.8 OB，pH 11 OB）先后经冰丙酮脱除中性脂肪，氯仿-甲醇溶液（2∶1）脱除磷脂，挥干有机溶剂，得到油体蛋白质。

精确称取约100 mg油体蛋白样品于水解管中，用 6 mol／L HCl水解（110℃，22 h）。将水解产物定容后过滤，滤液置于干燥器中蒸酸过夜（干燥器其中盛放NaOH固体）。再用0.02 mol／L HCl复溶，离心后用邻苯二甲醛（OPA）柱前自动衍生化，用液相色谱仪进行氨基酸组成分析。

色氨酸测定采用6 mol／L NaOH水解（110℃，20 h）。水解液经转移、中和、定容、离心后，用OPA柱前自动衍生化后进行氨基酸组成分析。计算各油体样品的每种氨基酸含量占氨基酸总量的百分比。

1.2.6 高碱性提取对大豆油体中中性脂脂肪酸组成的影响

称取60～80 mg新鲜制备的中性脂（丙酮提取物，方法同1.2.3.1）对其进行甲酯化处理，用正己烷回收甲酯化产物，然后采用气相色谱仪测定，用面积归一化法对脂肪酸进行定量。

1.2.7 高碱性提取对大豆油体中生育酚组成的影响

新制备的2种油体（未分散于水中，且未经透析处理），以1∶10的固液比加入冰丙酮（含0.1 mg／mL BHT）抽提中性脂部分，充分搅拌2 h，抽滤，收集滤液。重复提取3次后将得到的滤液合并。35℃真空浓缩除去丙酮。对真空浓缩之后的中性脂离心处理（10 000 r／min，15 min）。取上层透明油相约 1.5 g，按 GB／T 26635—2011／ISO 9936∶2006方法进行低温皂化处理，生育酚提取物用无水乙醇定容至10 mL。按GB／T 5009.82—2003进行HPLC分析。

2 结果与分析

2.1 高碱性提取对大豆油体表面蛋白质成分的影响

pH 11强碱性提取得到的大豆油体表面蛋白质基本仅含有油体蛋白24 ku油体蛋白和18 ku油体蛋白（图1）。pH 6.8 OB含有大豆7S球蛋白（图1中 α’，α，β）和11S球蛋白（图1中条带 A3，A，B）以及Gly m Bd 30K等杂蛋白；pH 11 OB表面基本上只剩下油体蛋白，其他杂蛋白被去除。碱性条件可以破坏油体表面携带的杂蛋白与油体的相互作用，有利于这些杂蛋白质脱离油体。7S和11S等杂蛋白的等电点大多呈酸性，高碱pH远离杂蛋白的等电点，杂蛋白带有很强的负电荷，因此比较容易从油体表面脱落。

图1 pH条件对大豆油体表面蛋白质成分的影响

2.2 高碱性提取条件对大豆油体主要成分含量的影响

由表1可知，pH 11 OB与pH 6.8 OB相比，中性脂含量增加，蛋白质以及磷脂含量均明显减少，这与2.1结果相一致。其中，蛋白质质量分数由8.33%（pH 6.8 OB）减小为5.33%（pH 11 OB），磷脂质量分数由5.80%（pH 6.8 OB）减小为2.65%（pH 11 OB）；中性脂质量分数由85.67%（pH 6.8 OB）增加为91.93%（pH 11 OB）。进一步分析可得，磷脂含量从0.068 g／g中性脂减小为0.029 g／g中性脂，蛋白含量从0.097 g／g中性脂减小为0.058 g／g中性脂。产生这种结果的原因可能有2种：1）pH 11强碱性条件使得油体杂蛋白（7S，11S，Gly m Bd 30K）以及油体蛋白逐渐脱离油体，进而使得磷脂与油体蛋白相互作用形成的结构也受到一定程度的影响，从而导致部分磷脂脱离油体；2）pH 11强碱性条件使得磷脂分子结构遭到破坏（比如磷脂极性头的水解）而致使磷脂含量降低。

表1 高碱性提取对大豆油体主要成分含量的影响

2.3 高碱性提取对大豆油体的粒径及zeta电位的影响

由图2a可见，因此，pH 11 OB粒径（451±7）nm明显小于pH 6.8 OB（509±3）nm。该结果也可以由2.1及2.2的结果解释，由于pH 11高碱性提取时，油体表面的部分蛋白质和磷脂会脱离油体，因此，pH 11 OB的粒径减小。此外，本试验中，大豆油体的蛋白质含量明显高于其他植物种子（油菜籽、芥菜子、棉花籽、玉米、花生、芝麻等）油体［11］，这是由于其他植物种子油体粒径一般为0.5～2.5μm［1］，大豆油体的尺寸更小，只有200～500 nm［12］，具有较大的表面积／体积，因此大豆油体含有较高比例的蛋白质是合理的。

由图2b可见，与pH 6.8 OB相比，表面蛋白质均是油体蛋白的pH 11 OB的等电点向碱性移动。pH 6.8 OB的等电点在4.5～5之间，pH 11 OB的等电点在5.5～6之间（更靠近于5.5）。这是由于pH 6.8 OB表面结合的杂蛋白（大豆7S、11S球蛋白以及 Gly m Bd 30K、P34）均为酸性蛋白［13-14］，这些酸性蛋白使得pH 6.8 OB的等电点偏向酸性；而油体蛋白均为碱性蛋白［15］，因此，pH 11 OB的等电点增大。

图2 高碱性提取对大豆油体的平均粒径分布及zeta电位的影响

2.4 高碱性提取对大豆油体氨基酸组成分析

表2所示为pH 6.8 OB和pH 11 OB蛋白质中各种氨基酸的摩尔分数。由表2分析可得，随pH值增加，整体上，疏水性氨基酸含量增加。原因是随提取pH值增加，油体杂蛋白脱离油体，油体蛋白成为油体表面的主要蛋白质；而油体蛋白是疏水性蛋白，因此，油体蛋白质疏水性氨基酸含量增加。

表2 高碱性提取对大豆油体氨基酸的影响

2.5 高碱性提取对大豆油体中中性脂脂肪酸组成的影响

表3所示为pH 6.8 OB和pH 11 OB的中性脂中各种脂肪酸的含量。由表3可见，对于pH 6.8 OB与pH 11 OB的中性脂而言，脂肪酸组成基本上是相同的。该结果表明，pH 11强碱性提取条件不会对油体中心部位的中性脂产生影响。同时也说明油体所拥有的天然乳化结构可以很好地保护TAGs免受外界环境的干扰与破坏。

表3 高碱性提取对大豆油体中性脂脂肪酸组成的影响

2.6 高碱性提取对大豆油体中生育酚组成的影响

图3可见，2种油体的中性脂部分中生育酚的含量基本相同。其中，α-生育酚含量在0.015～0.02 mg／g中性脂范围内；β和γ-生育酚的总含量在0.24～0.27 mg／g中性脂范围内；δ-生育酚含量在0.47～0.50 mg／g中性脂范围内。由于生育酚是脂溶性物质，它存在于油体中间的疏水部位（即中性脂）。该结果说明，油体的乳化结构能够很好的保护中性脂中的生育酚，即使是pH 11的强碱性提取条件。因此，油体有利于保护生育酚，这使得油体作为生物活性物质的天然载体具有广阔的应用前景。

图3 高碱性提取对大豆油体生育酚组成的影响

3 结论

碱性提取条件已广泛应用于油体的提取，虽然高碱性提取能够获得纯净、不含有过敏性蛋白及其他杂蛋白质的油体，但是它在一定程度上仍会改变所提取油体的成分和性质。尤其是对大豆油体表面的蛋白质和磷脂成分产生较为显著的影响；然而对核心的中性脂部分（脂肪酸组成、生育酚组成）却基本无影响。同时也证明了油体特殊的天然乳化结构可以保护其内的TAGs，在植物种子的贮藏中对于防止植物种子中TAGs的分解、氧化等具有重大意义。

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Composition Changes of Soybean Seed Oil Body by High-Alkaline Extraction

Cao Yanyun Chen Yeming Hua Yufei
（State Key Laboratory of Food Science and Technology School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

The resech herein described had taken soybean oil body as study object.It was discrete intracellular organelle for storing triacylglycerols（TAGs），being composed of neutral lipid（mainly TAGs）matrix shielded by a monolayer of phospholipids embedded with special proteins.Alkaline extraction has been extensively adopted for oil body preparation；high-alkaline condition is beneficial for pure oil body extraction.However，the effect of high alkaline condition on oil body components is not clear.Thus，the high-alkaline effects on the following items have been studied as follows：neutral lipid，protein and phospholipid contents；protein composition and its amino acid composition；fatty acid composition；tocopherol composition in oil body.Particle size distribution and zeta potential of oil body were also studied.The results showed that high-alkaline condition has a great influence on protein as well as phospholipid on oil body surface while nearly no influence on the neutral lipid.High-alkaline condition would cause protein and phospholipid release from oil body，namely，the value of proteins／neutral lipids decreased from 0.097（pH 6.8 OB）to 0.058（pH 11 OB）and phospholipids／neutral lipids decreased from 0.068（pH 6.8 OB）to 0.029（pH 11 OB）.Average particle decreased from（509±3）nm（pH 6.8 OB）to（451±7）nm（pH 11 OB），while the isoelectric point range increased from4.5～5（pH 6.8 OB）to 5.5～6（pH 11 OB）.It was also demonstrated that naturally emulsified structure of oil body could protect the TAGs from damaging.

soybean seed oil body，protein，phospholipids，neutral lipids，alkaline extraction，amino acid composition，fatty acid，tocopherol

TS221

A

1003-0174（2014）03-0037-05

2013-05-23

曹艳芸，女，1989年出生，硕士，大豆油体蛋白

陈业明，男，1982年出生，副教授，植物蛋白