红景天配伍维生素C 对大鼠运动性肾脏缺血再灌注的保护作用

2014-01-08周海涛曹建民

天然产物研究与开发 2014年10期

周海涛，曹建民，林强*

1北京联合大学，北京 100023;2 北京体育大学，北京 100084

随着现代中医药理论的发展、现代药理学理论及现代生物技术的更新，更多的单剂或配伍组方应用于体育实践。中药以其多靶点、多途径作用且几乎不含违禁成分的特点日益显示出其独特的优势，肾为先天之本，主骨骼生精髓;补肾中药对肾脏具有保护功效，其在肾脏缺血再灌注保护机制值得深入研究。

机体在稳定状态下，肾血流量可以通过自身调节机制来维持相对恒定。在剧烈运动时，肾血流在神经和体液因素的影响下发生改变。由于各器官血流量重新分配，使活动器官特别是肌肉的血流量增多，肾血流量急剧下降，并伴随运动过程的持续和强度递增表现的更加明显［1］。肾脏的这种不完全缺血状态形成了“运动性肾缺血”。运动停止后，肾血供应恢复形成运动性肾缺血后的“再灌注”［2］。缺血再灌注损伤过程中，自由基的产生异常增多起着重要作用。研究表明，红景天具有较高的抗氧化活性，可以清除体内过量生成的自由基对机体细胞的损伤［3］，维生素C 作为体内重要的抗氧化剂，可以有效清除自由基。本文研究红景天配伍维生素C对大鼠缺血再灌注肾脏的影响，并探讨二者在缺血再灌注损伤中的作用及其机制，旨在为其临床应用提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 动物

清洁级雄性Wistar 大鼠100 只，42 d 龄，平均体重(198.1 ±13.4)g，北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证号SCXK(京)2006-0008。在整个实验过程中，实验室内温度保持在(22 ±2)℃，相对湿度55%～75%，光照时间随自然变化。所有实验大鼠均以基础饲料(北京大学医学部实验动物科学部提供)和蒸馏水常规饲养，自由饮食。实验时间为63 d，正式训练时间为56 d。

1.2 实验用药

红景天(Rhodiola rosea)，产自河北，北京同仁堂购得，批号:120413537 并经天津中瑞药业有限公司高占友高级工程师鉴定。称取红景天干品50 g 加水500 mL，浸泡30 min 后煎30 min，将所得水煎液过滤，再将过滤出的红景天加水500 mL 煎30 min，将所得水煎液过滤。将2 次过滤出的水煎液混合，浓缩至生药浓度1g(生药)/mL，4 ℃存放备用。

1.3 试剂

血清肌酐(serum creatinine，Scr)采用Jaffe 苦味酸法测定，血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)采用二乙酰-肟法测定，丙二醛(malondialdehyde，MDA)采用比色法测定;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，采用黄嘌呤氧化酶法测定，均采用南京建成生物工程研究所提供试剂盒，试剂盒编号20120509，并严格按照使用说明操作。

1.4 仪器

BS224S 型电子分析天平(德国赛多利斯);光学显微镜(日本OLYMPUS 公司);ALCYON300 全自动生化分析仪(美国雅培);756M C 型紫外-可见分光光度计(上海精密仪器厂);GL-20G 高速冷冻离心机(上海安亭)。

2 实验方法

2.1 动物分组

实验大鼠适应性饲养4 d 后，以20 min/d 的运动量对其进行为期3 d 的筛选，淘汰个别不适应游泳训练者，将剩余大鼠以数字随机分组法分6 组:对照组(C 组)12 只，一般训练组(M 组)12 只，过度训练组(OM 组)24 只，红景天+过度训练组(ROM组)16 只，维生素C+过度训练组(VCOM 组)16 只，红景天+维生素C+过度训练组(RVCOM 组)16 只进行56 d 的游泳训练。训练期间，ROM 组、RVCOM组采用专业灌胃器灌胃(ig)，每天一次，剂量为4.48 g/kg［3］，ig 体积为5 mL/kg;VCOM 组、RVCOM组采用腹腔注射(ip)，剂量为100 mg/kg，每天一次，注射体积为0.5 mL(通过预实验获得最佳剂量)，其他各组ig 等量生理盐水。

2.2 实验方法。

2.2.1 训练及测试方案

C 组常规饲养，不加任何干预，平时不运动。M组进行中等强度游泳训练，正式游泳训练8 周。每周训练6 d，每天训练1 次，第一次下水游20 min，此后逐渐增加，至第1 周末时每天游60 min，第2 周末时加至每天游90 min，第3 周末时加至每天游120 min，此后5 周均保持此运动量。其他各组前3 周训练安排同M 组，第4 周起开始安排高强度训练。大鼠进行负重游泳，每次训练至力竭。力竭标准以大鼠下沉后10 s 不露出水面为度。第1～3 周负0.5%体重，第4 周负1%体重，第5 周负2%体重，每天训练1 次。第6 周每天上、下午各训练1 次，第7～8 周，每天上、下午、夜间各训练1 次，均负5%体重。至第8 周末，C、M 组大鼠，均正常生长，无意外死亡发生。其他各组大鼠因尾部负重，疲劳衰竭不能恢复及训练意外死亡等原因，死亡率较高。OM组、ROM 组、VCOM 组、RVCOM 组分别剩余14、13、12、14 只。各组分别取10 只用于实验取材，其他随机剔除。

2.2.2 指标测定

各组大鼠于末次游泳训练24 h 后，乙醚适度麻醉，从颈总动脉处取血加入柠檬酸钠溶液抗凝，37℃水浴中30 min 后，4 ℃3000 rpm 离心10 min，分离制备血清，置-20 ℃冰箱中保存待查。迅速取双肾，剔除筋膜，置于预冷的生理盐水中洗净血污，肉眼观察肾脏大小，色泽、质地。分离左肾，取肾上极组织0.5 g，用1.5 mL 生理盐水在1 ℃下以12000 r/min 研磨制成10%肾组织匀浆;10%甲醛固定肾组织标本，石蜡包埋，制成4 μm 厚切片，HE 染色，观察组织病理学变化。

2.2.3 肾脏病理变化评价

参照Pallers 标准［4］，400 倍光镜下随机选5 个视野，每个视野选10 个肾小管评分。肾小管明显扩张，细饱扁平为1 分;刷状缘损伤为1 分;脱落为2分;细胞膜大泡为1 分;细胞浆空泡为1 分;间质水肿1 分;肾小管腔内有脱落的坏死细胞未形成管型或碎片为1 分;形成管型或碎片为2 分。肾小管评分由两名技术员双盲计算，取平均值。

2.3 数据统计

所有数据均用SPSS 12.0 统计软件包进行处理，数据以均数±标准差表示，资料进行正态性检验;多组计量资料采用one-way ANOVA，方差齐时采用LSD 法，方差不齐时采用Dunnett's T3 法。P＜0.05 有统计学意义。

3 实验结果

3.1 运动及红景天、维生素C 对大鼠肾组织的病理改变

光镜下静止对照组、一般训练组大鼠肾组织结构正常，无淤血、变性和水肿，肾小管管腔内无管型。过度训练组大鼠肾小球有淤血现象，小管上皮细胞水肿、空泡变性、管腔扩张，管腔中有少量的脱落绒毛和上皮细胞，以及各种管型。其他各组组织病理学改变较过度训练组轻，有轻微的小管上皮细胞水肿、空泡变性，管腔扩张现象，无蛋白管型和细胞管型。各组大鼠肾小管Paller［4］评分，C 组、M 组组间无显著差异(P＞0.05)，C 组明显低于其他组(P＜0.01)，治疗组显著低于OM 组大鼠(P＜0.05)，且均未见肾小球明显病理改变。

表1 各组大鼠肾小管损害评分比较(n=10，± s)Table 1 Tubular damage score in various groups of rats (n=10，± s)

注:与C 组比较，1)表示P ＜0.05，2)表示P ＜0.01;与OM 组比较，3)表示P ＜0.05，4)表示P ＜0.01。Note:compared with C group，1)represent P ＜0.05，2)represent P ＜0.01;compared with OM group，3)and 4)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively.

3.2 运动及红景天、维生素C 对大鼠血清BUN 和SCr 的影响

由表2 可知:血尿素氮和血清肌酐各组与C 组相比，M 组、OM 组、ROM 组、VCOM 组、RVCOM 组，明显上升，分别为P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01、P＜0.05;与OM 组相比ROM 组、VCOM组、RVCOM 组明显下降，分别为P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01;与VCOM 组相比，ROM 组、RVCOM组明显下降，分别为P＜0.05，P＜0.01。

表2 各组大鼠血清尿素氮和肌酐含量比较(n=10，± s)Table 2 Blood urea nitrogen (BUN)and serum creatinine(SCr)levels in plasma of various groups (n=10，± s)

注:与C 组比较，1)表示P ＜0.05，2)表示P ＜0.01;与OM 组比较，3)表示P ＜0.05，4)表示P ＜0.01;与VCOM 组比较，5)表示P ＜0.05，6)表示P ＜0.01。Note:compared with C group，1)represent P ＜0.05，2)represen t P ＜0.01;compared with OM group，3)and 4)represent P ＜0.05 and P ＜0.01;compared with VOCM group，5)and 6)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively.

表3 各组大鼠肾组织匀浆中SOD 活性和MDA 含量比较(n=10，± s)Table 3 Comparison of rat kidney homogenate SOD activity and MDA content in each group (n=10，± s)

注:与C 组比较，1)表示P ＜0.05，2)表示P ＜0.01;与OM 组比较，3)表示P ＜0.05，4)表示P ＜0.01;与VCOM 组比较，5)表示P ＜0.05，6)表示P ＜0.01。Note:compared with C group，1)represent P ＜0.05，2)represent P ＜0.01;compared with OM group，3)and 4)represent P ＜0.05 and P ＜0.01;compared with VOCM group，5)and 6)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively.

3.3 运动及红景天、维生素C 对大鼠肾组织匀浆中SOD 活性和MDA 含量的影响

由表3 可知:SOD 活性，与C 组对比，M 组、OM组、ROM 组、VCOM 组、RVCOM 组，明显下降，分别为P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01、P＜0.05;与OM 组相比ROM 组、VCOM 组、RVCOM 组明显上升，分别为P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01;与VCOM组相比，ROM 组、RVCOM 组明显上升，分别为P＜0.05，P＜0.01。MDA 含量与C 组对比，M 组、OM组、ROM 组、VCOM 组、RVCOM 组明显升高，分别为P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01、P＜0.05;与OM 组相比，ROM 组、VCOM 组、RVCOM 组明显下降，分别为P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01;与VCOM组相比，ROM 组、RVCOM 组明显降低，分别为P＜0.05、P＜0.01。

4 讨论

肾缺血再灌注(Ischemic reperfusion，I/R)损伤是一个复杂的病理生理变化过程，其具体机制尚未完全阐明。但氧自由基(Oxygen free radicals，OFR)在I/R 发生、发展过程中起着至关重要的作用［5］。正常情况下，体内可产生少量自由基，但由于体内具有灭活自由基酶系统，自由基被迅速清除，不产生损伤作用。运动时由于I/R 使自由基产生增加，可引发膜脂质过氧化反应，导致膜的液态性、流动性及通透性改变，进而造成膜功能障碍，尤其是线粒体膜的破坏将影响细胞的代谢和机能，并干扰整个器官的生理功能。机体内存在清除自由基、减轻其危害的主要物质是抗氧化酶。SOD 是需氧生物体内数千种酶中以氧自由基为底物的唯一酶。其通过催化超氧阴离子形成过氧化氢而清除超氧阴离子，保护机体免受损伤，同时在一定范围内，自由基代谢增强时，SOD 会代偿性增加。因此SOD 活性的高低是机体抗氧化能力强弱的标志。MDA 是细胞脂质过氧化的一种主产物。组织线粒体MDA 含量是目前公认的衡量机体自由基代谢的敏感指标。肌酐和尿素氮分别是肌肉和蛋白质的分解代谢产物，主要经血循环从肾脏排除体外，其血中的浓度取决于肾小球滤过能力，当肾脏实质受到损伤，肾小球滤过率降到临界点后，二者的浓度就会明显上升［6］。

实验结果显示8 周过度训练已造成大鼠肾脏运动性缺血“再灌注”损伤，肾功能受到严重损坏，肾组织组织病理学发生改变。但肾组织组织病理学改变方面，ROM 组、VOM 组、RVOM 组(P＜0.05)较OM 组明显减轻。血尿素氮和血清肌酐方面，ROM组、VCOM 组、RVCOM 组低于OM 组，分别为P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01。SOD 活性方面，ROM 组、VCOM 组、RVCOM 组明显高于OM 组，分别为P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01。MDA 含量方面，ROM 组、VCOM 组、RVCOM 组低于OM 组，分别为P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01。表明，红景天及维生素C 可以有效清除自由基，减轻肾脏的缺血缺氧，抑制脂质过氧化作用，提高SOD 活性。有效减轻肾脏缺血再灌注损伤，起到保护作用。其机制可能为:1、红景天的主要成分红景天苷和苷元酪醇，都具有酚羟基。酚羟基作为清除自由基的主要功能基团，可通过清除体内过量生成的自由基对机体细胞的损伤，激活抗老化酶(SOD)的活性，降低脂质过氧化物(LPO)的浓度，抑制脂褐素在组织细胞中的堆积，保护腺体结构［7］;2、红景天中含有的多元酚类化合物、黄酮类化合物和超氧化歧化酶等也具有抗氧化作用，可以提高大鼠运动时自由基的消除，保护腺体结构;3、红景天多糖自动氧化，产生新的有机自由基，使多糖本身产生自由基与它清除的自由基达到或超过平衡，从而提高大鼠运动时自由基的消除;4、红景天内含Cu-Zn-SOD 与Mn-SOD，是重要的超氧自由基清除剂，直接提供并增加SOD 水平，维持细胞膜的完整性与稳定性［8］;5、红景天能够维持体内免疫系统处于平衡状态，既能提高机体免疫功能，又能防止免疫系统的矫枉过正，阻止炎性细胞因子的过度生成，减轻氧化应激程度［9］;6、维生素C 是重要的抗氧化维生素，作为强抗氧化剂可有效清除氧自由基、抑制凋亡级联的启动而减轻细胞、器官的缺血再灌注损伤［10］。此外，3 个治疗组间比较，血尿素氮、血清肌酐、MDA 含量，ROM 组(P＜0.05)，RVCOM 组(P＜0.01)低于VCOM 组;SOD 活性，ROM 组(P＜0.05)，RVCOM 组(P＜0.01)高于VCOM 组。提示红景天对运动性肾脏缺血再灌注损伤的疗效可能优于维生素C;而二者配伍使用可能更有利于缺血再灌注损伤肾脏的保护。

综上所述，红景天和维生素C 均对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用，可能是通过增强超氧化物歧化酶活性，清除自由基，减轻脂质过氧化作用，进而改善肾脏功能。就疗效而言，二者配伍使用优于二者单独应用，而红景天又优于维生素C，但也可能和二者在应用中的剂量大小有关，其剂量和疗效之间的关系，还有待进一步研究。

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