牡丹籽饼粕中芍药苷类成分及其大孔吸附树脂纯化研究

秦爱霞 ，纪殊晶，毛文岳，高 哲，康小虎，贾亚楠，陈 灿，崔 同*

1河北农业大学食品科技学院，保定 071000;2菏泽尧舜牡丹生物科技有限公司，菏泽 274000

牡丹籽为毛茛科芍药属灌木牡丹(Paeonia sufruticosaAndr.)的种子，中国民间有用牡丹籽美白皮肤，缓解腰腿疼痛，治疗口腔溃疡等的记载［1］。研究表明牡丹籽中有很多活性成分，如芍药苷(图1)、芍药内酯苷、6'-O-β-D-葡萄糖芍药内酯苷、βgentiobiosylpaeoniflorin［1-3］等。这些芍药苷类成分具有抗氧化、抗癌［4］、抗炎、抗过敏、抗凝血、免疫调节［5］、保护慢性动脉脑缺血［6］、改善记忆［7］、减缓辐射诱导的胸腺细胞［8］和肺细胞损伤［9］等很多作用，可用于开发新型药物制剂。目前芍药苷多以白芍和赤芍等为原料提取［10-12］，这种途径受种植周期和资源所限生产成本较高。

近年来富含亚麻酸和亚油酸的牡丹籽油已被批准为新食品资源［13，14］，而且高产籽用牡丹品种已大面积推广种植［15］，工业规模的超临界萃取油脂加工也已经投产。而以牡丹籽粕为原料提取药用成分芍药苷的相关研究却尚未见报道。

大孔树脂吸附法具有选择性强、吸附容量大、吸附速度快、解吸容易、成本低等优点［16］，在芍药药用成分提取分离中曾被采用［11，12］。本研究拟针对牡丹籽饼粕的特点，对其中芍药苷类成分进行定性定量分析，并通过筛选树脂、考察静态、动态吸附与解吸性能，建立一套适宜牡丹籽粕中芍药苷类成分提取纯化的新方法，为牡丹籽天然产物资源综合开发利用提供科学根据。

图1 芍药苷的分子结构Fig.1 The structure of paeoniflorin

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牡丹籽粕由山东菏泽尧舜牡丹生物科技有限公司提供;大孔吸附树脂HPD-100、HPD-200A、HPD-600A、D-101、D101A、HPD-750、HPD-826 以及HPD-500 型，由沧州宝恩化工有限公司提供，ADS-7、ADS-17 和AB-8 型由天津南开合成科技有限公司提供;氘代二甲基亚砜、四甲基硅，北京博雅大北科技开发公司;高效液相色谱(HPLC)流动相用甲醇为色谱纯;水为三蒸水;其余试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

分析型HPLC，Agilent 1200 型(安捷伦公司，美国加州帕罗阿托市)。配用CO-3010 柱恒温控制箱(天津美瑞泰克科技有限公司)。制备型HPLC，LC3000 型(北京创新通恒科技有限公司)，配Sino-Chrom ODS-BP C18(300 mm × 20.0 mm id，10 μm)色谱柱。LC-MS 系统，由Agilent 1200 型LC、Agilent 6310 型MS 检测器、ESI 电离源(Agilent 公司)组成。核磁共振仪，Avance III 600 MHz 型，Bruker 公司生产。AB10X-B 恒流泵，常州飞尔林流体有限公司;玻璃中压层析柱(10 mm × 300 mm)，上海楚定分析仪器有限公司。

1.3 对照品的制备

称取过40 目筛的牡丹籽粕1 kg，以料液比1:10 加入70%(v/v)乙醇溶液，室温下浸泡8 h，抽滤，残渣按上述条件重复提取两次，合并滤液，在55 ℃水浴下真空浓缩，得牡丹籽粕乙醇提取液备用。将浓缩液调整至8.0 mg/mL，用HPD-200A 大孔吸附树脂纯化，收集乙醇洗脱液经浓缩、过0.45 μm 滤膜后，用制备HPLC 制备纯化，色谱条件:流动相为甲醇:水=40 ∶60(v/v，含0.05%甲酸)，流速:10 mL/min，检测波长:230 nm，柱温:室温(25 ℃)，分别收集各色谱峰，再分别重复进样纯化，用分析型HPLC 以峰面积百分比法检测馏分的纯度均在95%以上，将收集液减压浓缩，冻干，制得纯化合物用作对照品。

1.4 对照品的LC-MS 分析

LC 分析条件:色谱柱为Hypersil BDS C18(100 mm × 2.1 mm id，3 μm);柱温30 ℃;流动相为40%甲醇(v/v，含0.05%甲酸)，流速0.6 mL/min;二极管阵列检测器;检测波长230 nm;进样量5 μL。

MS 分析条件:ESI 离子源，阴离子检测模式，喷雾器压力:40 psi;干燥气体温度:350 ℃，流速:12 L/min;离子阱质量分析器扫描范围:m/z=50～1000。

1.5 对照品的1H NMR 分析

称取制备的对照品各5 mg，分别用氘代二甲基亚砜溶解，以四甲基硅为基准试剂进行1H NMR 分析。

1.6 HPLC 定量方法

精密称取对照品(见1.3)，用40%甲醇配制成2.0 mg/mL 储备液，取储备液适当稀释进样，峰面积外标法定量。色谱条件:色谱柱:Kromasil C18(200 mm × 4.6 mm id，5 μm);流动相:40%甲醇水溶液(v/v);柱温:30 ℃;检测波长:230 nm;流速:0.8 mL/min;进样量:5 μL。

1.7 静态吸附动力学曲线

准确称取预处理［16］的树脂2.00 g(湿重)于100 mL 具塞磨口三角瓶中，加入30 mL 样液(按1.3所述方法制得的乙醇提取液)，室温下以100 rpm 频率振摇吸附，每隔30 min 取上清液，采用1.6 所述方法测定其中芍药苷的含量，绘制树脂的吸附量随时间变化的曲线。

1.8 大孔树脂纯化芍药苷的条件优化

1.8.1 动态吸附条件的优化

称取适量经预处理的大孔吸附树脂湿法装柱(10 mm × 200 mm)，用去离子水平衡树脂柱，上样，分管收集流出液，每1/2 柱床体积(BV)为1 管，用1.6 所述方法测定芍药苷含量。当流出液中芍药苷浓度达上样浓度的10%时，即认为已达到吸附泄漏点，停止上样。通过计算吸附量考察样品溶液浓度、上样速度对吸附效果的影响。

1.8.2 洗脱条件的优化

采用不同浓度的乙醇溶液在恒温振荡器中对吸附饱和的树脂进行解吸，并用1.6 所述方法测定溶液中芍药苷含量计算解吸率，确定最佳洗脱液浓度并考察洗脱液用量对洗脱效果的影响。

1.9 树脂重复使用周期的考察

按照最优的吸附和洗脱条件，取芍药苷粗提液在同一根树脂柱上反复进行活化、吸附、洗脱，重复操作10 次，分别测定吸附液和解吸液中芍药苷浓度，计算吸附率和解吸率。收集洗脱液，浓缩，干燥，分别计算芍药苷的纯度，评价树脂重复使用的吸附能力和效果。

2 结果与讨论

2.1 化合物1、2、3 和4 的结构分析

采用1.3 所述的提取和纯化方法，收集12、14、17 和21 min 左右的色谱馏分，精制后制得1、2、3 和4 号化合物(色谱图见图2)。采用1.4 方法对四种化合物进行LC-MS 分析得到化合物的紫外吸收光谱和离子质荷比数据，采用1.5 方法进行1H NMR分析得到化合物的化学位移、偶合常数等信息，结果如下:

化合物1 UV nm λmax232，274 (MeOH);(-)ESI-MSm/z687 ［M+HCOO］-，641 ［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz):δ 1.82 (1H，d，J=15.0 Hz，H-3α)，2.36 (1H，dd，J=15.0，6.4 Hz，H-3β)，4.19 (1H，d，J=7.8 Hz，H-4)，2.76 (1H，m，H-5)，2.09 (1H，d，J=10.9 Hz，H-7α)，2.67(1H，t，J=9.3，9.3 Hz，H-7β)，4.62 (1H，d，J=12.0 Hz，H-8α)，4.56 (1H，s，H-8β)，1.38 (3H，s，H-10)，4.43 (1H，d，J=7.7 Hz，H-1')，3.00～3.08(1H，m，H-2'，4'，5')，3.28 (1H，t，J=8.8，8.8 Hz，H-3')，4.53 (1H，dd，J=4.4，10.5 Hz H-6'α)，3.68 (1H，dd，J=4.7，11.3 Hz，H-6'β)，8.02 (2H，d，J=7.3 Hz，H-2'')，7.56 (2H，t，J=7.7，7.7 Hz，H-3'')，7.68 (1H，t，J=7.4，7.4 Hz，H-4'')，7.56 (2H，t，J=7.7，7.7 Hz，H-5'')，8.02 (2H，d，J=7.3 Hz，H-6'')，5.10 (1H，d，J=5.2 Hz，H-1''')，3.43 (1H，m，H-2''')，3.08～3.15 (2H，m，H-3'''，4''')，3.43 (1H，m，H-5''')，5.13 (1H，d，J=4.7 Hz，H-6'''α)，4.62 (1H，s，H-6'''β)。以上数据与文献［17］报道的结果吻合，鉴定为化合物1 为6'-O-β-D-葡萄糖芍药内酯苷。

化合物2 UV nm λmax232，274 (MeOH);(-)ESI-MSm/z525［M+HCOO］-，479［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz):δ 1.85 (1H，d，J=15.0 Hz，H-3α)，2.30 (1H，dd，J=6.6，15.1 Hz，H-3β)，4.12 (1H，t，J=5.5，5.5 Hz，H-4)，2.78(1H，m，H-5)，1.91 (1H，d，J=10.8 Hz，H-7α)，2.68 (1H，dd，J=7.9，10.7 Hz，H-7β)，4.56 (1H，d，J=7.2 Hz，H-8α)，4.64 (1H，m，H-8β)，1.34(3H，m，H-10)，4.41 (1H，t，J=7.7 Hz，H-1')，3.01～3.06 (1H，m，H-2'，3'，4'，5')，3.65 (1H，d，J=11.3 Hz，H-6'α)，3.39 (1H，s，H-6'β)，8.02(2H，d，J=7.2 Hz，H-2'')，7.55 (2H，dd，J=8.3，15.9 Hz，H-3'')，7.68 (1H，t，J=7.4，7.4 Hz，H-4'')，7.55 (2H，dd，J=8.3，15.9 Hz，H-5'')，8.02 (2H，d，J=7.2 Hz，H-6'')。以上数据与文献［17］结果吻合，鉴定为化合物芍药内酯苷。

化合物3 UV nm λmax232，274 (MeOH);(-)ESI-MSm/z687 ［M+HCOO］-，641 ［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz):δ 1.64 (1H，d，J=12.2 Hz，H-3α)，2.07 (1H，d，J=12.2 Hz，H-3β)，2.43 (1H，d，J=6.4 Hz，H-5)，1.93 (1H，d，J=10.6 Hz，H-7α)，2.39 (1H，m，H-7β)，4.67 (1H，d，J=12.2 Hz，H-8α)，4.62 (1H，d，J=12.2 Hz，H-8β)，5.33 (1H，s，H-9)，1.28 (1H，s，H-10)，4.42(1H，d，J=7.7 Hz，H-1')，3.04 (1H，m，H-2')，3.17 (1H，m，H-3')，3.11(1H，m，H-4')，2.97 (1H，m，H-5')，3.98 (1H，d，J=10.9 Hz，H-6'α)，3.44(1H，s，H-6'β)，7.99 (2H，t，J=8.0，8.0 Hz，H-2'')，7.56 (2H，t，J=7.8，7.8 Hz，H-3'')，7.69(1H，t，J=7.4，7.4 Hz，H-4'')，7.56 (2H，t，J=7.8，7.8 Hz，H-5'')，7.99 (2H，t，J=8.0，8.0 Hz，H-6'')，4.22 (1H，d，J=7.8 Hz，H-1''')，3.04(1H，m，H-2''')，3.17 (1H，m，H-3''')，3.11 (1H，m，H-4''')，3.33 (1H，m，H-5''')，3.68 (1H，d，J=11.5 Hz，H-6'''α)，3.48 (1H，d，J=7.7，11.6 Hz，H-6'''β)。与文献［18］吻合，鉴定该化合物为β-gentiobiosylpaeoniflorin。

化合物4 UV nm λmax231，274 (MeOH);(-)ESI-MSm/z525 ［M+HCOO］-，479 ［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz):δ 1.82 (1H，d，J=10.7 Hz，H-3α)，2.06(1H，t，J=10.4，10.7 Hz，H-3β)，2.44 (1H，t，J=10.1，10.1 Hz，H-5)，1.65(1H，d，J=12.1 Hz，H-7α)，2.38 (1H，dd，J=6.8，10.6 Hz，H-7β)，4.65 (2H，m，H-8)，5.35 (1H，d，J=23.6 Hz，H-9)，1.24 (3H，m，H-10)，4.39(1H，d，J=7.7 Hz，H-1')，2.93～3.15 (1H，m，H-2'，3'，4'，5')，3.39 (1H，d，J=6.2 Hz，H-6'α)，3.65 (1H，d，J=10.8 Hz，H-6'β)，7.99 (2H，t，J=7.8，7.8 Hz，H-2'')，7.55 (2H，dd，J=8.6，16.3 Hz，H-3'')，7.69 (1H，t，J=7.4，7.4 Hz，H-4'')，7.55 (2H，dd，J=8.6，16.3 Hz，H-5'')，7.99 (2H，t，J=7.8，7.8 Hz，H-6'')。1H NMR 数据与文献［19］报道的芍药苷数据吻合，鉴定该化合物结构为芍药苷。

图2 纯化的6'-O-β-D-葡萄糖芍药内酯苷(1)、芍药苷内酯(2)、β-gentiobiosylpaeoniflorin(3)及芍药苷(4)的HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of purified 6'-O-β-D-glucopyranosylalbiflorin (1)，albiflorin (2)，β-gentiobiosylpaeoniflorin (3)and paeoniflorin (4)

2.2 牡丹籽粕粗提液成分分析

按1.3 所述方法对牡丹籽粕进行乙醇提取，得到浓缩液480 mL。用1.6 所述方法对提取液成分进行HPLC 分析，结果如图3 所示，1～4 号色谱峰分别为6'-O-β-D-葡萄糖芍药内酯苷、芍药内酯苷、β-gentiobiosylpaeoniflorin 和芍药苷，以芍药苷含量最高，占提取物干重的8.36%(按1.6 方法计算)，其余3 种成分含量分别为3.43%、3.92%和2.50%。因此本文试验以芍药苷为评价指标，采用树脂吸附法对牡丹籽粕粗提物进行纯化。

图3 牡丹籽饼粕醇提取物的HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of crude extract of seed cakes of P.sufruticosa

2.3 树脂的筛选

树脂的极性和空间结构是影响其吸附特性的重要因素［20］。本试验考察了极性、中极性、弱极性的11 种大孔吸附树脂对芍药苷的静态吸附与解吸性能，结果见表1。由表1 可以看出，随着树脂极性的逐渐增强，其对芍药苷的吸附能力会很有规律的逐渐下降，其中非极性的HPD-200A 对芍药苷的静态吸附量最高，氢键型的ADS-17 最低。95%乙醇对各树脂的解吸能力差别较大且没有明显规律，其中HPD-200A 和HPD-750 的解吸率较高达到90%以上，而AB-8 和ADS-17 两种树脂的解吸率较低，不足30%。综合吸附量和解吸率的结果，选用HPD-200A 树脂用于芍药苷纯化的后续试验。

表1 各种树脂的类型、吸附量及解吸率Table 1 Type，adsorption capacity and desorption rate of the 11 investigated resins

2.4 静态吸附动力学曲线

以吸附时间为横坐标，吸附量为纵坐标作图，得到HPD-200A 大孔吸附树脂对芍药苷的静态吸附动力学曲线，如图4 所示。由图4 可见，HPD-200A 大孔吸附树脂可快速吸附芍药苷，30 min 内变化迅速，1 h 达到吸附平衡。

图4 HPD-200A 树脂对芍药苷的静态吸附动力学曲线ig.4 The kinetic curve of static adsorption of HPD-200A resin

2.5 大孔树脂纯化条件的优化

2.5.1 上样浓度对吸附效果的影响

分别以浓度为4.0、6.2、7.4、8.5 和9.6 mg/mL的芍药苷粗提液以1/16 BV/min 的流速上样进行动态吸附，每1/2 BV 收集一管，测定其中芍药苷的浓度，考察上样浓度对吸附效果的影响。以收集管数为横坐标、流出液中芍药苷浓度与上样液中芍药苷浓度之比为纵坐标，绘制吸附透过曲线，结果见图5。

图5 不同浓度的芍药苷样液在HPD-200A 树脂柱上的吸附透过曲线Fig.5 The adsorption breakthrough curve of different concentrations of paeoniflorin solutions on HPD-200A resin column

由图5 可知，随着上样浓度的增加，穿透点逐渐提前，在浓度高于8.5 mg/mL 时，流出液中芍药苷浓度随上样量的增大快速增加，而浓度低于6.2 mg/mL 时，流出液中芍药苷浓度增加缓慢。上样浓度过低，树脂出现泄漏点缓慢，达到吸附饱和时所需时间较长;浓度过高，树脂的泄漏点出现较早，树脂未能充分吸附，使其利用率降低。因此，综合以上因素本试验选择8.0 mg/mL 作为上样液的浓度，上样体积为4.5 倍柱体积。

2.5.2 流速对吸附效果的影响

将浓度为8.0 mg/mL 的提取液分别以0.5、1、1.5、2、2.5 mL/min 流速进行动态吸附，比较不同流速对吸附效果的影响，绘制吸附透过曲线，结果见图6。由图6 可知，随着流速增加泄漏点的出现会逐渐提前，经计算其树脂的吸附量会逐渐减少，这是因为流速过大时上样液中的芍药苷未能被树脂充分吸附，造成吸附效率降低。较小的流速虽然有利于芍药苷的充分吸附，但操作时间会相应延长，生产效率低。综合考虑工作效率和吸附效果，我们推荐采用1 mL/min 的上样速度较为适合，大约相当于1/16 BV/min。

图6 不同上样流速下芍药苷在HPD-200A 树脂柱上的吸附透过曲线Fig.6 The adsorption breakthrough curve of paeoniflorin solutions with different flow rates on HPD-200A resin column

2.6 大孔吸附树脂洗脱条件的优化

2.6.1 乙醇浓度对洗脱效果的影响

向吸附平衡的树脂中分别加入浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、95% 的乙醇溶液30 mL，按1.9 所述方法充分解吸，测定洗脱液中芍药苷的含量，比较不同浓度乙醇溶液的解吸效果。结果如图7。由图中可见，当乙醇浓度在40%以下时解吸不够完全，50%～70%的乙醇可以达到很高的解吸率，继续提高乙醇浓度解吸率不再提高。考虑生产成本和安全性的因素，最终选用50%的乙醇溶液为洗脱液。

图7 乙醇浓度对洗脱效果的影响Fig.7 The effect of ethanol concentration on desorption

2.6.2 洗脱液用量的确定

按2.3 确定的最优吸附条件上样，吸附之后用2 BV 去离子水淋洗树脂柱以除去水溶性杂质。再用50%乙醇溶液以流速1.0 mL/min 进行洗脱。收集洗脱液(每1/2 BV 为1 管)，测定含量并绘制解吸曲线，如图8 所示。由图8 可见，当洗脱体积为2～3 BV 时，洗脱液中的芍药苷含量达到最大值，并且洗脱峰相对集中、无明显拖尾现象，约4 倍柱体积洗脱液可将芍药苷基本洗脱完全，解吸率为93.0%。

图8 芍药苷动态洗脱曲线Fig.8 The dynamic elution curve of paeoniflorin

2.7 树脂重复使用周期的考察

HPD-200A 树脂的重复使用结果如表2 所示。由表中可以看出，吸附率和解吸率首次最高，分别为84.9%和94.3%，之后渐渐下降，到第四次后基本保持稳定，而芍药苷的纯度无明显下降。说明树脂柱对芍药苷的死吸附很少，树脂可重复使用多次而不需要再生。重复吸附解吸10 次，收集液的干物质中芍药苷的平均含量为32.3%，同时6'-O-β-D-葡萄糖芍药内酯苷，芍药内酯苷和β-gentiobiosylpaeoniflorin 的平均含量分别为8.02%、16.5%和6.63%。

表2 HPD-200A 树脂柱重复使用的性能变化Table 2 Changes of adsorption properties of HPD-200A resin with repeated usage

3 结论

采用制备HPLC 等方法从牡丹籽粕醇提物中分离纯化了4 种主要成分，经UV、MS、NMR 分析鉴定其分别为6'-O-β-D-葡萄糖芍药内酯苷，芍药内酯苷，β-gentiobiosylpaeoniflorin 和芍药苷，其中以芍药苷含量最高。通过静态吸附、解吸试验从11 种备选树脂中筛选出HPD-200A 型大孔吸附树脂，其对牡丹籽中芍药苷的较佳纯化工艺参数为:样液浓度8.0 mg/mL，上样速度1/16 BV/min，上样体积4.5 BV，洗脱液乙醇浓度50%，洗脱流速1/16 BV/min，洗脱体积4 BV。在此条件下树脂重复使用10 次其吸附率、解吸率以及所得产品纯度无明显下降。经树脂分离纯化的提取物中含有芍药苷32.3%，芍药内酯苷16.5%，6'-O-β-D-葡萄糖芍药内酯苷8.02%，β-gentiobiosylpaeoniflorin 6.63%。

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